Zineb通过影响ERK1/2磷酸化损害斑马鱼的脊索和骨骼发育

《Journal of Environmental Sciences》：Zineb impairs notochord and skeletal development in zebrafish by affecting the ERK1/2 phosphorylation

　　

• •
  Zineb暴露导致脊椎发育缺陷、骨骼矿化障碍以及颅面软骨畸形。
• •
  Zineb作用的时间窗口决定了脊索畸形发生的位置。
• •
  Zineb暴露可以抑制细胞增殖并破坏凋亡平衡。
• •
  Zineb暴露可以抑制ERK/p-ERK蛋白及相关基因的表达。
• •
  激活p-ERK可显著挽救Zineb诱导的脊索损伤，并在脊索位点部分恢复p-ERK及脊索发育相关基因的表达。

引言

农药在现代农业中对防治害虫、病害和杂草至关重要（Tang等，2024），从而提高了作物产量，并在人口需求增长的背景下支持了全球粮食安全（Godfray等，2010）。然而，农药的大量使用因其残留物在环境中的积累而导致了明显的不良影响（Damalas和Eleftherohorinos，2011）。这些化合物可通过挥发、飘移和径流进入生态系统，污染土壤和水资源。随后，它们通过受污染的食物链和水源对人类健康和生态安全构成潜在风险（Schleiffer和Speiser，2022）。

Zineb是一种乙二胺二硫代氨基甲酸锌杀菌剂，由于其广谱活性和低毒性，在农业和防污应用中广泛使用（Campanale等，2023；Soloneski等，2001）。其主要代谢物乙撑硫脲（ETU）（Zhang等，1991）在土壤中具有高度迁移性，被美国环境保护署（EPA）列为可能的致癌物（Cassella等，2002）。环境监测数据表明，Zineb已在饮用水和番茄样品中以0.7至4.5 μmol/L的浓度被检测到（Karako?和Nakibo?lu，2013），在土壤中的残留水平为0.01–2.00 mg/kg（Ming-xi，2015）。尤其令人担忧的是，虽然梨中喷施的Zineb残留物在7天内降解，但其代谢物ETU降解要缓慢得多，残留物仍可检出0.02–0.01 mg/kg。尽管在商业罐装梨或婴儿食品中未检出Zineb，但存在ETU残留物（0.05 mg/kg），这凸显了评估Zineb及其代谢物毒性的重要性。先前的研究表明，Zineb主要抑制单加氧酶系统，干扰电子传递，损害病原体的毒素代谢和能量转化，从而抑制其生长（Nebbia等，1997）。在虹鳟（Oncorhynchus mykiss）中的暴露实验也表明Zineb在肝脏中显著蓄积（Van Leeuwen等，1986）。此外，5%的Zineb在Drosophila模型中诱导隐性致死突变，表明其具有潜在的遗传毒性（Osaba等，2002）。总之，鉴于Zineb在环境中的广泛存在、其生物蓄积潜力以及ETU的致癌性——再加上毒理学认识仍然有限——迫切需要进一步进行风险评估研究。来自水生模型的实质性证据表明，DTCs可以诱发严重的致畸作用（Park等，2021；Tilton等，2006）。尽管DTCs的环境存在及其诱导脊索缺陷的能力已经确立，但目前仍不清楚环境浓度的Zineb是否能引起相关的脊索发育障碍，其具体效应及潜在的分子机制是什么。

斑马鱼（Danio rerio）为此类研究提供了理想的平台。作为环境毒理学中的模式生物，其高繁殖力、体型小和对水生污染物的高敏感性使其成为生态毒理学测试和风险评估的基础模型（Mu等，2013）（Santoriello和Zon，2012）。重要的是，其胚胎的天然透明度允许对脊索形态进行实时、无侵入性观察。其明确的骨骼细胞谱系和对脊索信号的高度依赖性（Giffin等，2019），结合已建立的遗传学和分子工具，构成了一个强大的体系，用于分析污染物如何干扰脊索发育及后续的成骨级联反应（Busse等，2020；Chen等，2017）。这使其成为研究人类脊柱畸形（如先天性脊柱侧凸和脊柱后凸）的理想模型（Bearce等，2022）。

基于此背景，本研究旨在系统阐明环境相关浓度的Zineb对斑马鱼胚胎脊索和骨骼发育的发展毒性，并探索其潜在的分子机制。我们将结合形态学表征、三卡因和Ro 67-7476的药理学干预，以及基因和蛋白水平的多层次分子验证，重点关注ERK1/2信号级联在Zineb诱导的致畸效应中的作用。本研究有望填补DTC杀菌剂对脊椎动物轴向发育毒理学认识的空白，并为Zineb的生态风险评估和环保安全阈值的优化提供科学依据。

章节摘要

鱼品系与试剂

转基因斑马鱼Tg(twhh:GFP)转基因系、Tg(elavl3:GFP)转基因系和野生型（AB）斑马鱼均购自中国斑马鱼资源中心（武汉，中国）。斑马鱼的饲养遵循先前描述的饲养条件（Cao等，2016）。动物在28 ± 0.5°C下进行14小时光照/10小时黑暗的循环。本研究中使用的试剂如下：Zineb（C₄H₆N₂S₄Zn，CAS：12122-67-7）购自上海麦克林生物化学

急性Zineb暴露诱导斑马鱼胚胎发育缺陷和脊索畸形

为了系统评估Zineb的潜在发育毒性，将4 hpf的斑马鱼胚胎暴露于环境相关浓度的Zineb（2、4、8 μmol/L）中，直至72 hpf。基于72 hpf-LC??值为150 μmol/L，确认这些浓度为亚致死浓度，确保观察到的发育缺陷并非急性死亡所致。暴露组中观察到了异常表型。Zineb浓度增加导致显著的

讨论

自20世纪60年代以来，农药的广泛使用与小麦、水稻和玉米等主要粮食作物产量的翻番直接相关。如果没有农药保护，全球粮食产量可能下降30%-50%，可能导致粮食价格飙升，对粮食安全构成严重威胁（Oerke，2005）。然而，伴随着农药使用的激增，由农药残留引起的环境健康问题日益突出。农药

结论

总之，本研究表明，暴露于环境相关亚致死浓度的Zineb显著损害斑马鱼胚胎的早期发育。这表现为特征性的螺旋状脊索畸形，包括脊索细胞空间排列严重紊乱、颅面软骨畸形以及骨骼矿化异常。此外，Zineb暴露显著降低了脊索细胞的增殖密度并且

利益冲突声明

作者声明，他们没有任何已知的 competing financial interests 或个人关系可能影响本文所报告的工作。

未引用参考文献

Axmon等，2008，Bearce等，2022

CRediT作者贡献声明

李叶豪：原稿撰写，可视化，方法学，形式化分析。王志鹏：原稿撰写，方法学，数据整理，概念构思。王子昂：审稿与编辑，调查研究，形式化分析，数据整理，概念构思。张雨萱：可视化，验证，数据整理。吴道宇：软件，方法学，形式化分析。沈沁源：可视化，验证，数据整理，概念构思。黄宇涵：。高兴：可视化，

利益冲突声明

作者声明，他们没有任何已知的竞争利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。

致谢

本研究得到国家自然科学基金（编号：32370896和82560418）、江西省"双千计划"（编号：jxsq2023201122）、江西省儿童发展重点实验室项目（编号：2024SSY06191）以及江西省自然科学基金（编号：S20258619和20242BAB25444）的资助。

李叶豪|王志鹏|王子昂|张雨萱|吴道宇|沈沁源|黄宇涵|高兴|万茜|胡伟涛|肖忠浩|唐景蓉|叶志军|张秀华|肖菊华|施晓文|李慧敏|曹志刚