《Advanced Science》：ACSL4-Dependent Lysosomal Lipid Peroxidation Links WTAP-Mediated m6A Modification to Intervertebral Disc Degeneration
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椎间盘退变（intervertebral disc degeneration，IVDD）是腰痛发生的主要原因，但其表观遗传调控机制尚不清楚。研究人员在此鉴定了一种N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）RNA修饰促进IVDD中溶酶体膜通透
椎间盘退变（intervertebral disc degeneration，IVDD）是腰痛发生的主要原因，但其表观遗传调控机制尚不清楚。研究人员在此鉴定了一种N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）RNA修饰促进IVDD中溶酶体膜通透化（lysosomal membrane permeabilization，LMP）的机制。人髓核（nucleus pulposus，NP）组织的单细胞转录组分析显示，在严重退变的NP细胞中溶酶体通路基因富集，同时伴随LMP和线粒体自噬流受损。研究人员进一步证明，白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）可诱导LMP、破坏线粒体自噬流，并导致NP细胞线粒体功能障碍。IL-1β增强了WTAP（m6A甲基转移酶复合物的关键组分）的表达，WTAP对于ACSL4 mRNA的m6A甲基化至关重要。随后，m6A阅读蛋白IGF2BP2结合并稳定修饰后的转录本，导致ACSL4表达增加。最终，通过含花生四烯酸磷脂的积累促进溶酶体脂质过氧化，导致LMP。在大鼠模型中，椎间盘内递送AAV9-shWTAP可减轻椎间盘退变，表现为椎间盘高度保留、细胞外基质合成改善，以及溶酶体功能和线粒体自噬恢复。该研究揭示了WTAP/ACSL4/IGF2BP2轴作为IL-1β诱导LMP的介质，通过m6A依赖性脂质过氧化发挥作用，突出了IVDD的潜在治疗靶点。
**论文解读：WTAP/ACSL4/IGF2BP2轴经m6A依赖性脂质过氧化介导溶酶体膜通透化并促进椎间盘退变**
**一、研究背景与科学问题**
腰痛是全球范围内严重影响生活质量的常见疾病，约影响6.32亿人，并给家庭和社会带来沉重经济负担。腰椎间盘突出是腰痛的主要病因之一，其通常源于椎间盘退变（intervertebral disc degeneration，IVDD）。在退变过程中，内层髓核（nucleus pulposus，NP）逐渐丢失水分和蛋白聚糖，改变椎间盘的结构与力学性能，最终导致纤维环破裂、髓核突出及神经根受压等症状。尽管创伤、衰老和过度负荷等因素已被证实参与IVDD发病，但其潜在分子机制仍十分复杂，有待深入阐明。
溶酶体含有多种酸性水解酶，负责降解蛋白质、核酸和多糖等生物大分子。溶酶体膜的完整性对其功能与稳态至关重要。溶酶体膜通透化（lysosomal membrane permeabilization，LMP）可被活性氧和光损伤等多种应激源诱导，导致组织蛋白酶等水解酶释放至胞浆，引发溶酶体依赖性细胞死亡。研究人员前期工作已表明，氧化应激诱导的LMP通过损害溶酶体自噬功能，加速NP细胞衰老，直接参与人类IVDD的病理过程。此外，过度负荷亦可导致LMP、自噬流受损及NP细胞死亡。然而，LMP在IVDD发病中的确切作用和机制仍需进一步探究。
N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）是真核细胞中一种保守的转录后RNA修饰，通过写入器、擦除器和阅读器蛋白的协同作用，影响mRNA的可变剪接、翻译、稳定性及转运。甲基转移酶复合物由甲基转移酶样3（METTL3）、Wilms瘤1相关蛋白（WTAP）和METTL14组成，负责m6A标记的安装。去甲基化酶ALKBH5和FTO可移除m6A修饰。阅读蛋白如胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白（IGF2BPs）和YTHDF家族可识别m6A修饰的mRNA并发挥调控作用。虽有研究初步探索了IVDD中NP组织的m6A甲基化模式，且Yang等人报道WTAP调控的lncRNA NORAD的m6A修饰促进NP细胞衰老和IVDD发展，但m6A表观遗传修饰是否参与NP细胞的LMP过程及IVDD进展仍属未知。
**二、研究内容与结论**
本研究旨在阐明IL-1β诱导的LMP损伤作为IVDD潜在驱动因素的分子机制。研究人员通过整合单细胞转录组分析、MeRIP-seq、脂质组学及动物模型等多层次手段，系统解析了m6A修饰在IVDD中调控LMP和线粒体自噬的具体机制。
研究发现，IL-1β刺激可增强退变NP细胞溶酶体膜通透性，破坏线粒体自噬并加重线粒体功能障碍。机制上，IL-1β上调WTAP表达，WTAP作为m6A甲基转移酶复合物的关键组分，介导ACSL4 mRNA的m6A甲基化。m6A阅读蛋白IGF2BP2识别并结合m6A修饰的ACSL4 mRNA，增强其稳定性，导致ACSL4蛋白水平升高。 upregulated ACSL4促进含花生四烯酸的磷脂积累，驱动溶酶体脂质过氧化，最终引发LMP。在大鼠IVDD模型中，椎间盘内注射AAV9-shWTAP可有效减轻椎间盘退变，表现为椎间盘高度保留、细胞外基质合成改善及溶酶体功能和线粒体自噬恢复。该研究揭示了WTAP/ACSL4/IGF2BP2轴通过m6A依赖性脂质过氧化介导IL-1β诱导的LMP的崭新机制，为IVDD治疗提供了潜在靶点。
**三、主要关键技术方法**
研究人员使用了以下核心技术方法：①对公开的人类NP组织单细胞转录组数据集（GSE251686和GSE153066）进行生物信息学分析；②甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）及MeRIP-qPCR鉴定m6A修饰靶点；③RNA pull-down联合质谱鉴定m6A阅读蛋白；④脂质组学分析检测磷脂种类变化；⑤透射电子显微镜观察溶酶体超微结构；⑥激光共聚焦和超分辨显微镜评估LMP、线粒体形态及自噬流；⑦在大鼠尾椎穿刺IVDD模型中通过椎间盘内注射AAV9-shWTAP进行体内干预验证。
**四、研究结果**
**（一）溶酶体膜通透化破坏退变椎间盘中的线粒体自噬**
通过对人NP组织单细胞转录组数据集（GSE251686）的分析发现，随退变程度加重，NP细胞比例从65%降至39%。严重退变的NP细胞中溶酶体相关基因（CTSB、CTSD、CTSK、CTSL）差异表达，KEGG通路分析显示溶酶体通路显著富集，并在独立数据集（GSE153066）中得到验证。蛋白质水平检测显示严重退变样本中成熟CTSB和CTSD水平显著降低，CTSB/CTSD与LAMP1的共定位减少。透射电镜观察到严重退变NP细胞出现溶酶体膜破裂和内容物泄漏。线粒体自噬相关蛋白（LC3-II/I比值、PINK1、p62、BNIP3）在严重退变NP组织中显著升高，提示线粒体自噬降解功能受损。使用LLOME诱导LMP可复现上述线粒体自噬流损伤表型，证实LMP是NP细胞线粒体自噬受损的直接驱动因素。
**（二）IL-1β诱导NP细胞LMP并损害线粒体自噬降解**
IL-1β处理呈时间依赖性降低胶原II表达并上调MMP13。IL-1β刺激导致溶酶体膜破裂，LGALS3 puncta（约60个/细胞）与LAMP1共定位增加，成熟CTSB/CTSD水平下降，线粒体自噬相关蛋白（PINK1、p62、BNIP3、LC3-II/I）表达上调。BafA1处理实验和mCherry-GFP-LC3串联报告实验证实，IL-1β主要损害自噬溶酶体降解能力而非增强自噬体合成。IL-1受体拮抗剂Anakinra可逆转上述效应，确认IL-1β的特异性。此外，IL-1β处理的NP细胞线粒体膜电位下降、线粒体ROS水平升高，表明受损线粒体积累。
**（三）ACSL4的m6A修饰介导LMP和线粒体自噬流损伤**
MeRIP-seq分析共鉴定对照组41,866个m6A峰、IL-1β处理组39,651个峰，m6A位点主要富集于外显子和3'UTR区域，共识基序为RRACU。ACSL4的m6A修饰水平及其mRNA和蛋白表达在IL-1β刺激后显著升高。敲低ACSL4可挽救IL-1β诱导的成熟CTSB/CTSD下降，减少LGALS3 puncta数量，减轻LC3-II、p62和BNIP3积累，并部分恢复线粒体管状网络，表明m6A介导的ACSL4上调导致NP细胞LMP和线粒体自噬流障碍。
**（四）WTAP介导的ACSL4 m6A修饰驱动LMP并破坏线粒体自噬流**
Western blot显示IL-1β刺激后WTAP蛋白水平显著升高。敲低WTAP可消除IL-1β诱导的ACSL4 mRNA高甲基化，抑制ACSL4在mRNA和蛋白水平的升高，恢复成熟CTSB/CTSD水平，减少LGALS3 puncta阳性受损溶酶体数量，并改善线粒体形态。ACSL4过表达可逆转WTAP敲低的保护效应，重新诱导LGALS3 puncta形成、降低成熟组织蛋白酶水平并加重线粒体自噬标记物积累，证实ACSL4是WTAP下游的关键效应分子。
**（五）IGF2BP2通过m6A修饰增强ACSL4 mRNA稳定性**
RNA pull-down联合质谱鉴定出IGF2BP2与m6A修饰的ACSL4 mRNA强相互作用。敲低IGF2BP2抑制IL-1β诱导的ACSL4表达。Actinomycin D追踪实验显示，IGF2BP2敲低使ACSL4 mRNA半衰期从10.97 h缩短至6.14 h。MeRIP-seq分析鉴定了ACSL4外显子区的一个m6A峰（109,644,109–109,643,984）。突变两个潜在m6A位点（1947/1985A>G）后，IGF2BP2敲低对突变型ACSL4表达无影响，证实IGF2BP2以m6A依赖性方式调控ACSL4 mRNA稳定性。
**（六）WTAP和ACSL4通过脂质过氧化介导溶酶体膜通透化**
IL-1β处理后NP细胞中BODIPY 581/591 C11被氧化，敲低WTAP或ACSL4可显著恢复其非氧化状态。IL-1β增加溶酶体4-HNE水平，WTAP或ACSL4敲低可明显改善此效应。敲低WTAP或ACSL4显著抑制IL-1β刺激的NP细胞中MDA形成。脂质组学分析显示，ACSL4敲低显著降低了IL-1β处理的NP细胞中含花生四烯酸的磷脂水平，特别是PE（C17:0/C20:4）和PC（P-C18:4/C20:4），这些是促进LMP的关键氧化底物。
**（七）抑制WTAP/ACSL4轴通过恢复溶酶体功能和线粒体自噬流减轻IVDD**
在大鼠针刺诱导的IVDD模型中，椎间盘内注射AAV9-shWTAP有效降低WTAP和ACSL4表达。MRI显示AAV9-shWTAP组椎间盘高度和信号强度得到显著保留。组织学染色（H&E、SO&FG、AB）显示WTAP敲低明显减轻髓核结构破坏和软骨细胞丢失。免疫组化显示WTAP敲低增强胶原II合成并降低MMP13水平。免疫荧光检测显示WTAP敲低部分恢复CTSB/CTSD水平，减少LC3、p62和BNIP3积累，并降低4-HNE水平。这些结果表明抑制WTAP/ACSL4轴可延缓IVDD进展。
**五、讨论与结论总结**
本研究证实LMP在IVDD发病中起关键作用，靶向抑制LMP可在体内有效缓解IVDD。研究鉴定出甲基转移酶WTAP是IL-1β刺激的NP细胞和退变椎间盘组织中显著升高的关键上游调控因子。机制上，WTAP以IGF2BP2依赖性方式促进ACSL4 mRNA的m6A修饰和稳定化，升高的ACSL4促进脂质过氧化，驱动溶酶体膜不稳定并最终导致LMP。单细胞转录组学和蛋白质组学分析揭示了严重退变NP组织中溶酶体通路富集改变和成熟组织蛋白酶水平降低的特征。研究还通过TFEB过表达实验提供了IL-1β诱导的LMP是驱动NP细胞线粒体自噬损伤的主要上游事件的直接因果证据。
值得注意的是，IL-1β与溶酶体损伤之间存在潜在的正反馈环路：溶酶体膜破裂释放组织蛋白酶可激活NLRP3炎症小体，促进IL-1β成熟，而慢性IL-1β暴露又进一步损害NP细胞溶酶体完整性。本研究还通过上位性拯救实验证实了WTAP/ACSL4轴的特异性。体内AAV9介导的WTAP沉默为靶向WTAP/ACSL4轴治疗IVDD提供了有力的临床前证据。
本研究的局限性包括：缺乏不同Pfirrmann分级的人IVD组织代谢组学数据；NP细胞在10%FBS中培养可能与体内表型存在差异；mRNA稳定性实验中放线菌素D处理后采样时间点不足；IL-1β诱导WTAP上调的上游分子机制尚不清楚；缺乏体内遗传拯救数据验证WTAP敲低通过ACSL4特异性改善椎间盘退变。
**研究结论：**本研究发现了一条IVDD的新致病通路：炎症环境增强WTAP介导的ACSL4 mRNA m6A修饰，该修饰由IGF2BP2稳定；升高的ACSL4驱动脂质过氧化，导致LMP；由此产生的溶酶体功能障碍损害线粒体自噬流，造成受损线粒体积累并促进细胞退变。WTAP/ACSL4/LMP/线粒体自噬轴代表了干预IVDD进展的有前景的治疗靶点。该研究发表在《Advanced Science》。
