《Journal of Food Composition and Analysis》：A targeted proteomics method for quantifying cartilage in various chicken raw materials
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摘要：禽肉中软骨的存在被认为是不期望的。研究人员通过全面的鉴定流程，利用液相色谱-四极杆-飞行时间-串联质谱法（LC-QToF-MS/MS）鉴定出四种源自鸡胶原蛋白IIα1和IXα1的新型胰蛋白酶软骨标志肽，且这些标志肽在肌腱和皮肤中未被检出。研究表明，仅对软
摘要：禽肉中软骨的存在被认为是不期望的。研究人员通过全面的鉴定流程，利用液相色谱-四极杆-飞行时间-串联质谱法（LC-QToF-MS/MS）鉴定出四种源自鸡胶原蛋白IIα1和IXα1的新型胰蛋白酶软骨标志肽，且这些标志肽在肌腱和皮肤中未被检出。研究表明，仅对软骨来源肽段进行定性检测不足以鉴定机械分离肉（MSM），因为这些肽段在拟进一步加工成肉制品的非机械分离肉（非MSM）中同样可检出，尽管浓度较低。为此，研究人员开发了一种基于基质匹配校准的定量方法（LC-QQQ-MS/MS），采用添加不同浓度脱脂软骨粉（0.01%、0.05%、0.1%、0.2%或0.5%）的鸡胸肉进行校准。通过广泛优化样品前处理流程（包括冻干、石油醚索氏脱脂、后续研磨以及大幅增加样品量），实现了用于常规分析的样品材料具有良好的均匀性。对源自胶原IXα1的软骨特异性肽段VMQEQLSQLAASLR进行的多反应监测（MRM）分析表现出最佳的定量性能，在所有软骨浓度水平下均获得低于15%的低相对误差（%RE）。该方法为评估商业化鸡肉原料中机械分离肉与非机械分离肉的潜在区分提供了基础。
论文解读：靶向蛋白质组学方法定量检测鸡肉原料中的软骨
一、研究背景与问题
机械分离肉（mechanically separated meat, MSM）是肉类加工中的一类特殊原料，其生产方式、组成及法规分类给分析检测带来了特定挑战。在欧盟法规框架下，MSM被定义为通过机械分离过程获得的产品，该过程导致肌纤维结构丧失或改变。法规上，MSM不被视为"肉"，仅可用于热处理肉制品且必须明确标示。然而，从分析角度看，目前尚无单一分析参数足以可靠鉴定MSM。现有检测策略主要基于骨或软骨相关变化，因为机械分离过程中的高压可导致骨碎屑磨耗、软骨及结缔组织等软组织的挤出。多年来，钙含量或骨含量被用作鉴定MSM的主要标准，但这类指标缺乏特异性。软骨组织富含胶原蛋白，其中II、IX和XI型胶原为软骨所特有。然而，所有28种已知胶原类型因甘氨酸-脯氨酸-羟脯氨酸或甘氨酸-脯氨酸-丙氨酸三联体的重复出现而具有相似的氨基酸序列，因此鉴定软骨所特有的、不存在于其他富含胶原组织（如肌腱或皮肤）中的标志肽面临重大挑战。已有的基于非特异性胶原检测的方法，如羟脯氨酸光度测定或光谱学方法，均不适用于软骨的特异性检测。此前虽有基于胶原II肽段的定性LC-MS/MS检测方法，但受专利保护且仅限于定性分析，限制了其在官方食品控制中的应用。由于软骨不仅存在于MSM中，也可能存在于拟进一步加工的肉（即"加工肉"，非MSM）中，因此需要一种定量方法来实现对不同原料中软骨含量的客观评估和区分。本研究旨在开发并验证一种适用于常规检测的LC-MS/MS方法，用于鸡肉产品中软骨物质的可靠检测与定量。
二、研究开展与主要技术方法
研究人员以德国多个加工厂的鸡肉和火鸡肉原料（包括鸡胸肉修整碎肉、MSM和鸡胸肉片）以及超市和禽肉加工企业的鸡软骨、肌腱和皮肤为样本，开展了一项系统的靶向蛋白质组学研究。主要技术方法包括：①采用冷冻均质（液氮预冷Grindomix）、丙酮加压液体萃取（PLE）脱脂和球磨粉碎对软骨、肌腱和皮肤进行前处理；②利用液相色谱-四极杆-飞行时间高分辨质谱（LC-QToF-MS/MS）结合PEAKS Studio从头测序进行标志肽发现；③通过固相肽合成制备候选肽标准品，并使用三重四极杆质谱的多反应监测（MRM）模式进行组织选择性验证；④采用冻干、索氏石油醚脱脂、陶瓷珠研磨等步骤优化样品制备，将样品量从25 mg大幅提高至500 mg以保证均匀性；⑤基于基质匹配校准（鸡胸肉添加0.01%-0.5%脱脂软骨粉）建立定量方法，使用1/x2加权线性回归评估肽段的定量性能。
三、研究结果
（一）软骨标志肽候选物的筛选
研究人员对鸡软骨、肌腱和皮肤三种基质进行LC-HR-MS/MS分析，共鉴定出1,538个肽段，其中826个在软骨中检出，316个为软骨组织所特有。经肽段长度筛选（剔除少于7个或多于20个氨基酸的肽段）、数据库检索及BLAST比对后，最终从7种不同靶蛋白中选出20个软骨标志肽候选物，涵盖胶原II、IX、XI型、matrilin-1、聚集蛋白聚糖、软骨寡聚基质蛋白（COMP）和软骨黏附素。BLAST检索表明，20个候选肽中有17个也存在于火鸡中，表明这些标志物不是物种特异性的，而是禽类软骨的通用标志物。
（二）组织选择性验证
通过MRM分析对20个候选肽进行组织选择性评估，排除4个信号强度显著较低（肽8、15、16、17）、1个在皮肤和肌腱中高表达（肽5）以及3个在肌腱中交叉检出（肽18-20）的候选肽。最终保留12个肽段，经MSM样品验证后，5个肽段表现出最高强度且无残留效应：GAQGPP*GATGFP*GAAGR、GIVGLP*GQR（胶原α-1(II)）、ISVDGFSVLGR、VMQEQLSQLAASLR（胶原α-1(IX)）和QEFPLGQFK（matrilin-1）。针对肌腱和皮肤的靶向组织选择性检测表明，与软骨相比，这5个肽段在肌腱中的峰面积最高仅为0.9%（GIVGLP*GQR），在皮肤中最高为0.03%，且在常见肉制品配料（蛋、奶、香草、香料及商业香料混合物）中均未检出，证实了其高度组织特异性。
（三）鸡胸肉片、加工肉和MSM中的软骨标志物存在情况
研究人员对来自两个不同禽肉加工厂的鸡胸肉片、加工肉（非MSM）和MSM各一份样品进行了三种重复分析。结果所有鸡胸肉片样品中均未检出软骨标志肽，而加工肉和MSM中均检出全部5个标志肽，且MSM中的峰面积一致地高于加工肉。这一发现证实仅凭定性检测不足以区分MSM和非MSM，与Branscheid和Troeger（2012）在非MSM碎禽肉中检出0.03%-0.25%软骨颗粒的报道相吻合。加热稳定性实验（100°C水浴30分钟）显示，四个软骨标志肽的峰面积仅降低0%-17%，表明这些标志物在加工条件下具有热稳定性。此外，matrilin-1来源的QEFPLGQFK因信号强度显著低于其他标志物而最终被排除。一个加工肉样品中四个软骨肽的RSD（55-72%）明显高于肉肽（8%）和胶原I肽（16%），反映出软骨颗粒在样品中分布不均匀，凸显了优化均质化处理对可靠定量分析的关键必要性。
（四）MSM样品均质化工艺优化
为获得更均匀的样品材料并增大处理量，研究人员比较了丙酮PLE法和索氏石油醚萃取法的脱脂效果。两种方法获得的四个软骨标志肽峰面积高度相似（石油醚法为丙酮法的88%-107%），表明索氏萃取可作为适合LC-MS/MS分析的样品制备方法，且能处理高达7 g冻干MSM的样品量。将样品量从25 mg提高至500 mg、缓冲液从1.5 mL增至15 mL后，三个主要软骨标志肽和禽标志物的RSD保持在2%-5%的较低水平，表明该方法具有可接受的重复性。
（五）鸡肉原料中软骨的定量
以未加标的鸡胸肉作为空白基质，制备含0.01%、0.05%、0.1%、0.2%和0.5%脱脂软骨粉的五点基质匹配校准曲线。评估了三种定量策略：未归一化、归一化至肉标志肽（IQLVEEELDR）和归一化至禽标志肽（NEELDAMIK）。采用1/x2加权后，所有校准曲线的拟合度显著改善。在三个定量标准中，未归一化的cartilage4（VMQEQLSQLAASLR）表现最优：在所有浓度水平下相对误差（%RE）均低于15%，∑%RE值最低（164），且在各浓度水平的重复性RSD均低于10%。相比之下，cartilage3因在低浓度下信噪比过低而产生不可接受的变异而被排除。研究人员认为cartilage4的优异表现可能源于其靶蛋白胶原IX：与形成纤维的胶原II不同，胶原IX属于FACIT家族，其三重螺旋被非胶原结构域中断，主要位于胶原II纤维表面，因此更易溶解和可及于胰蛋白酶。三批测试样品的反算浓度在低添加水平（0.0265%）下%RE较高（48-60%），但在0.1755%和0.3245%添加水平下，cartilage4的%RE分别降至8%-13%和1%-8%，均在15%-20%的可接受范围内。三个德国不同生产地点的MSM实际样品经定量，软骨粉平均含量分别为0.08%、0.09%和0.48%，落在校准曲线中高浓度范围内，证实了该方法的实际适用性。
四、讨论与结论
本研究的核心发现是：软骨标志肽的定性检出不足以作为鉴定MSM的可靠依据，因为非MSM原料中同样可检出软骨肽。这一发现与此前认为可通过软骨特异性肽的定性鉴定实现MSM检测的观点形成对比。研究结果表明，定量策略能够实现对不同原料中软骨含量的客观区分。研究建立了一种基于基质匹配校准的定量方法，在缺乏软骨含量认证参考物质的情况下，为鸡肉原料中MSM与非MSM的区分评估提供了实用基础。该LC-MS/MS方法确立的四个新型热稳定性胰蛋白酶软骨标志肽中，三个同样适用于火鸡软骨的检测。未来研究将扩展至更广泛的商业化鸡肉原料，评估该方法能否可靠区分MSM与非MSM，并探讨在鸡肉和火鸡肉产品以及鸡-火鸡混合产品中的应用可行性。
