《Journal of Hazardous Materials Advances》：Hexagonal boron nitride bio-interfacing the skin: role of shape and size in its safety profile assessed on 2D and 3D epidermal models
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摘要
六方氮化硼（hexagonal boron nitride, h-BN）凭借其独特的理化性质，是最具前景的二维材料之一。考虑到其技术应用潜力，对其进行危害表征对于确保消费者和工人的安全至关重要。鉴于皮肤接触是人类的主要暴露途径之一，本研究旨在：i）利用
摘要
六方氮化硼（hexagonal boron nitride, h-BN）凭借其独特的理化性质，是最具前景的二维材料之一。考虑到其技术应用潜力，对其进行危害表征对于确保消费者和工人的安全至关重要。鉴于皮肤接触是人类的主要暴露途径之一，本研究旨在：i）利用两种不同复杂程度的体外模型评估h-BN的皮肤效应；ii）探讨关键理化性质（形状和尺寸）是否会影响h-BN与表皮细胞的相互作用及其毒性。h-BN与人HaCaT角质形成细胞表现出良好的生物相容性：仅在长时间暴露（7天）且浓度>10 μg/mL时观察到轻微的细胞毒性和促炎效应，而在较短接触时间（24小时）后影响极低。这些效应似乎主要受h-BN薄片的形状和尺寸影响。事实上，与圆形h-BN相比，较大的锐边h-BN被角质形成细胞内在化的程度较低，但与质膜表现出更强的相互作用，损害膜完整性，从而引发更高的细胞损伤。然而，使用更具预测性的表皮模型——三维重建人表皮（reconstructed human epidermis, RhE），并采用经济合作与发展组织（Organization for Economic Cooperation and Development, OECD）提供的特定测试指南，h-BN被归类为对皮肤无腐蚀性和无刺激性。在该模型上，h-BN的生物相容性不受薄片形态的影响，这可能是由于表皮角质层（Stratum corneum）的保护屏障功能所致。总而言之，这些发现为涉及直接皮肤接触的h-BN应用的安全设计（Safe-by-Design）开发提供了宝贵的见解。
**论文解读：六方氮化硼皮肤生物界面安全性研究——形状与尺寸的影响**
**1. 研究背景与问题提出**
自2004年Novoselov和Geim分离出原子级薄石墨烯以来，二维（2D）纳米材料因其突破性的理化性质而受到越来越多的关注。其中，六方氮化硼（hexagonal boron nitride, h-BN）在科学和工业领域均具有重要地位，它是一种优良的电绝缘体，同时又是杰出的热导体。此外，h-BN还以其显著的热化学稳定性、抗氧化和抗腐蚀性、吸附特性以及显著的机械柔韧性而著称。这些特性使h-BN成为各种技术应用的理想候选材料，包括热机械、电子和生物医学领域。然而，随着对大规模工业应用的日益关注，了解该材料对人体健康的影响变得至关重要。由于大多数h-BN应用仍处于实验阶段，当前人类面临的主要风险与职业暴露相关，主要通过吸入或皮肤接触途径。
考虑到皮肤暴露的重要性，已有一些研究使用体外细胞模型（如成纤维细胞和角质形成细胞）报道了原始h-BN和/或h-BN纳米复合材料在皮肤水平上的效应。研究人员的课题组先前已证明，通过机械化学方法制备的研究级h-BN仅在高浓度（>25 μg/mL）且暴露时间长达72小时的情况下，才对HaCaT角质形成细胞产生微弱的负面效应。另一项长期研究表明，在4周内每周两次将HaCaT皮肤角质形成细胞和BEAS-2B支气管细胞暴露于低浓度（0.1-1 μg/mL）的原始和降解h-BN，未观察到细胞活力、促炎反应以及蛋白质组/代谢组图谱方面的重大细胞改变。
尽管这些数据表明该材料与皮肤模型生物界面作用时具有良好的生物相容性，但过去十年关于石墨烯及相关材料（GRMs）理化性质对其安全性特征影响的知识，应该作为实施h-BN危害表征的借鉴，符合安全设计（Safe-by-Design）原则。对GRMs的大量研究表明，其细胞毒性效应的强度因来源、合成过程以及主要理化性质而异。然而，这些特征对h-BN毒性潜力的作用目前仍处于初步研究阶段，现有研究非常有限。因此，本研究探讨了h-BN的两个主要理化性质（即形状和尺寸）如何影响其在皮肤水平的安全性特征。
**2. 研究内容与结论**
本研究采用比较方法，系统分析了两种在横向尺寸和形态上不同的h-BN，使用了两种不同复杂程度的体外模型：一种是由表皮角质形成细胞（HaCaT细胞系）代表的简化模型，另一种是由三维（3D）重建人表皮（RhE）组成的更具预测性和完整性的系统。研究评估了h-BN尺寸和形状对皮肤毒性相关不同参数的影响，包括细胞水平（表皮生物相互作用和内在化、细胞活力和炎症）和组织水平（皮肤生物相互作用、皮肤刺激和腐蚀）。在细胞水平上，考虑了短期（24小时）和长期（7天）暴露；在组织水平上，遵循经济合作与发展组织（OECD）提供的测试指南（TG），收集了稳健可靠的数据。
研究发现，h-BN在皮肤水平表现出良好的生物相容性：在HaCaT角质形成细胞中，仅在长时间暴露（7天）后观察到轻微的细胞毒性效应，而短时间接触（24小时）后影响极低。值得注意的是，这些效应仅在高浓度（>10 μg/mL）下出现。此外，h-BN的形状和尺寸成为影响其细胞毒性和生物相互作用的关键决定因素。锐边薄片被观察到插入质膜，与圆形薄片相比诱导更高的应激反应，而圆形薄片则保持在质膜上方包裹。
**3. 主要关键技术方法**
研究人员采用了多种关键技术方法：通过透射电子显微镜（TEM）和原子力显微镜（AFM）对两种h-BN材料的形状、尺寸和厚度进行理化表征；利用X射线衍射（XRD）分析晶体结构；使用改良的肿瘤坏死因子-α表达测试（TET）排除内毒素污染；采用WST-8还原实验、磺基罗丹明B（SRB）实验和碘化丙啶（PI）摄取实验评估细胞活力、细胞粘附和细胞膜完整性；使用酶联免疫吸附实验（ELISA）定量促炎介质；采用扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）、结构照明显微镜（SIM）和组织学分析观察材料与细胞的相互作用；按照OECD TG 431和TG 439测试指南在三维重建人表皮（RhE）模型上评估皮肤腐蚀和刺激性。两种h-BN材料（h-BNr和h-BNc）由BeDimensional S.P.A.（意大利热那亚）提供和生产。HaCaT细胞系购自Cell Line Services DKFZ（德国海德堡），THP-1细胞系购自美国典型培养物保藏中心（ATCC），SkinEthic? RhE模型购自EpiSkin（法国里昂）。
**4. 研究结果**
**4.1 h-BN的理化表征**
通过TEM和AFM测量对两种h-BN薄片进行了表征。h-BNc薄片具有棱角分明的边缘，横向尺寸分布呈对数正态分布，峰值为2079±119 nm；h-BNr薄片具有圆形边缘，横向尺寸峰值为851±34 nm。两种材料的厚度相似，峰值分别约为4.8 nm和4.3 nm，表明它们主要由少数层（≤10层）组成。统计分析显示两种h-BN薄片的平均横向尺寸存在显著差异（p<0.001），而厚度非常相似。XRD分析表明两种样品具有相似的晶体结构，但h-BNc表现出更尖锐和更强的峰，表明其结晶度和晶粒尺寸更高。
**4.2 内毒素定量**
为排除测试h-BN的任何内毒素污染，研究人员对THP-1分化巨噬细胞（dTHP-1）进行了TET实验。结果显示，在存在或不存在多粘菌素B硫酸盐的情况下，两种材料的内毒素水平均未超过美国食品药品监督管理局（FDA）规定的0.5 EU/mL限值，证实h-BNc和h-BNr均未受内毒素污染。
**4.3 h-BN对角质形成细胞的细胞毒性效应**
研究人员使用简化细胞模型HaCaT角质形成细胞进行了体外研究，评估了多种细胞参数。结果显示，h-BN与角质形成细胞之间存在非常稳定的相互作用，h-BNc通过其明显的边缘突起插入质膜，而h-BNr则表面包裹在角质形成细胞膜上方。SIM分析证实两种h-BN均被细胞内化，但方式不同：h-BNr在细胞质中的内在化程度是h-BNc的3.2倍，而h-BNc与质膜的关联更强。半定量分析表明，较小的横向尺寸促进了h-BNr的内在化，而h-BNc的尖锐边缘则促使其插入质膜。在细胞活力方面，24小时暴露未引起显著变化，但7天暴露导致浓度依赖性细胞活力降低，从10 μg/mL浓度开始。h-BNc的EC50值（28.6 μg/mL）比h-BNr（90.3 μg/mL）低3.2倍（p<0.05），表明h-BNc的细胞毒性效力显著更高。SRB实验显示，7天暴露后两种材料均导致细胞粘附的浓度依赖性降低，h-BNc的EC50值（11.3 μg/mL）比h-BNr（28.2 μg/mL）低2倍以上。PI摄取实验表明，7天暴露诱导浓度依赖性细胞内PI荧光增加，暴露于最高浓度h-BNc引起的PI摄取显著高于h-BNr（p<0.01）。
**4.4 h-BN对角质形成细胞的促炎效应**
研究人员定量了暴露于h-BN后细胞培养基中炎性介质（IL-1α、IL-6、IL-8、TNF-α）的水平。24小时暴露未显著刺激炎性介质释放，表明h-BN的促炎潜力极低。而7天处理后，h-BNc在10 μg/mL浓度下显著增加IL-6释放（1.7倍增加），在1 μg/mL和10 μg/mL浓度下显著增加IL-8释放（分别为2.6倍和3.3倍增加），后者与阳性对照LPS诱导的释放相当。h-BNr未引起显著变化。这些结果表明，只有h-BNc在长期暴露后具有显著的促炎潜力，再次证实形状和尺寸是影响h-BN炎症效应的关键参数。
**4.5 h-BN对三维重建人表皮（RhE）的效应**
研究人员使用商业化的SkinEthic? RhE模型，采用OECD TG 431和TG 439分别评估了h-BN的皮肤腐蚀性和刺激性。在腐蚀性评估中，3分钟暴露于h-BNc或h-BNr后RhE活力分别降至85%和93%，1小时暴露后分别降至88%和90%，这些值远高于OECD TG 431规定的腐蚀性预测阈值（3分钟暴露后<50%和/或1小时暴露后<15%），因此两种材料均被归类为非腐蚀性。在刺激性评估中，按照OECD TG 439，两种材料均未将RhE活力降低至阈值（≤50%），因此被归类为非刺激性。SEM和TEM分析显示，h-BN处理的RhE组织形态与阴性对照相当，未观察到角质层破坏或表面开裂的迹象。然而，h-BNr圆形薄片似乎表面粘附于表皮，而h-BNc薄片则倾向于嵌入表皮表面并卡在角质层中。组织学分析显示，两种材料均强烈粘附在角质层表面并积累，但均未能穿透表皮，在角质层下方的任何层中都未检测到材料沉积。这表明h-BN无法渗透完整的表皮，且该特性不受薄片形状和横向尺寸的影响。
**5. 讨论与结论**
本研究在安全设计框架下，系统评估了形状和尺寸对h-BN皮肤安全性特征的影响。细胞水平的结果表明，尽管较小的尺寸促进了h-BNr的内在化，但其生物影响极小，而h-BNc尽管内在化程度相对较低，但因其尖锐的边缘与质膜产生更强相互作用，可能损害膜完整性，从而引发更高的细胞毒性和促炎效应。因此，h-BN的整体形状似乎是影响其细胞毒性和促炎效应的更重要因素，而非仅取决于薄片的横向尺寸。在组织水平上，通过采用OECD TG 431和439获得的稳健可靠且适用于监管目的毒理学数据，排除了h-BN的腐蚀性和刺激性。这种组织水平的生物相容性似乎不受h-BN尺寸和形状的影响，这可能是由于角质层高度致密的角质形成细胞所提供的屏障特性赋予了对有害机械刺激的高抵抗力。
研究结论指出，h-BN薄片在细胞和组织水平均表现出高皮肤生物相容性。在角质形成细胞中，仅在长达7天的暴露时间下才诱导细胞毒性效应，且促炎效应可忽略不计。在三维人表皮模型中，高生物相容性得到无刺激性和无腐蚀性、无组织形态学改变以及组织内无材料积累等证据的支持。这些结果为h-BN的安全开发提供了宝贵见解，有助于提高对直接接触皮肤的相关技术产品（对工人和消费者而言）安全性特征的理解。此外，本研究所采用的方法代表了新兴材料安全性评估的一种模式，适用于直接接触皮肤的技术应用中使用的材料，包括水凝胶、气凝胶、纳米复合材料和含二维材料的平台。
