脑钙化相关的JAM2致病突变损害JAM2–JAM3紧密连接结构与血脑屏障完整性

《Brain Pathology》：Brain calcification-associated JAM2 pathogenic mutations impair JAM2–JAM3 tight junction structure and the blood–brain barrier integrity

　　

原发性脑钙化(PBC)是一种以双侧脑钙化为特征的神经退行性疾病。JAM2是PBC的致病基因，编码紧密连接蛋白JAM2，对血脑屏障(BBB)完整性至关重要，但其致病机制尚不明确。研究人员利用质粒构建、免疫沉淀、流式细胞术和结构建模分析了PBC患者中发现的两种JAM2错义突变。研究人员构建了Jam2基因敲除(KO)小鼠模型，通过组织学、伊文思蓝实验和原位杂交评估行为缺陷、脑钙化和BBB完整性。JAM2-W108C突变体表现出异常的亚细胞定位，而JAM2-R108H特异性破坏了JAM2–JAM3相互作用，与致病的JAM3-E116K突变相似。Jam2 KO小鼠在6–12月龄时出现中脑钙化(von Kossa染色)和运动障碍(转棒/平衡木实验)。JAM2和JAM3在脑内皮细胞中共定位，KO小鼠表现出BBB渗漏(伊文思蓝外渗)。JAM2-PBC的主要致病机制应与JAM2–JAM3异二聚体形成受损有关，该损害破坏了紧密连接和BBB完整性。该研究提示JAM2–JAM3相互作用可作为PBC及相关脑钙化疾病的潜在治疗靶点。

**论文解读：JAM2致病突变通过损害JAM2–JAM3紧密连接结构与血脑屏障完整性导致原发性脑钙化**

**一、研究背景与科学问题**

原发性脑钙化(PBC)是一种遗传性神经退行性疾病，其影像学特征为双侧脑部钙化沉积。患者临床表现高度异质性，涵盖运动障碍、认知功能障碍和精神疾病，目前临床上缺乏有效治疗药物。迄今已报道8个与PBC相关的致病基因，其中4个与常染色体显性遗传相关(SLC20A2、PDGFRB、PDGFB、XPR1)，4个与常染色体隐性遗传相关(MYORG、JAM2、CMPK2、NAA60)。隐性致病基因变异导致的临床表现通常比显性基因更为严重，预后更差，因此研究隐性基因的发病机制具有更重要的临床价值。

JAM2属于连接黏附分子(JAM)家族，是血管内皮细胞紧密连接相关的黏附分子。JAM2与JAM3、Occludin、Claudin-5等同属紧密连接蛋白家族，在脑中高表达，对维持血脑屏障(BBB)稳定性至关重要。值得注意的是，除JAM2外，JAM3、occludin和claudin-5的突变也已被报道与伴脑钙化的综合征性疾病相关，提示紧密连接损伤与脑钙化发生之间存在显著相关性。JAM2与JAM3蛋白可相互作用形成异源二聚体，表达于血管内皮细胞膜表面，从而维持BBB稳定性。基于上述背景，研究人员提出假设：JAM2致病突变通过损害紧密连接和BBB完整性导致PBC。

**二、主要技术方法**

研究人员构建了携带PBC患者中已报道的JAM2错义突变(p.R108H和p.W168C)的质粒载体，利用免疫荧光、流式细胞术检测突变蛋白的亚细胞定位和膜表面表达水平；运用RoseTTAFold结构预测、Chimera和PyMOL进行蛋白质三维结构建模分析；通过免疫共沉淀(Co-IP)检测JAM2与JAM3蛋白间的相互作用。动物实验方面，使用CRISPR-Cas9技术构建Jam2基因敲除(KO)小鼠模型(基于C57BL/6JGpt背景，由GemPharmatech提供)，通过转棒实验、平衡木实验和新物体识别实验评估运动与认知功能；采用von Kossa染色检测脑钙化；通过伊文思蓝外渗实验评估BBB通透性；运用RNAscope荧光原位杂交(FISH)检测Jam2和Jam3的组织表达与细胞共定位。

**三、研究结果**

**3.1 JAM2-W168C损害亚细胞定位**

JAM2蛋白包含两个结构域(Ig样V和Ig样C2)及一个跨膜区。在已报道的PBC相关JAM2变异中，p.R108H和p.W168C为错义变异，其余为截短变异。对于截短变异，患者来源的证据显示p.R229*纯合个体中JAM2 cDNA缺失，支持内源性JAM2表达丧失而非产生稳定截短蛋白的结论。功能分析显示，p.W168C突变体的亚细胞定位明显受损，发生细胞内滞留并与内质网标志物(Sec61和calreticulin)共定位；而p.R108H突变对亚细胞定位无明显影响。细胞免疫荧光染色和流式细胞术进一步证实，W168C突变蛋白在细胞膜表面的检出极少，而R108H突变蛋白的膜定位与野生型相比未见减少。

**3.2 JAM2-R108H影响JAM2–JAM3相互作用**

JAM2和JAM3通过其结构域相互作用形成异二聚体以执行紧密连接功能。JAM3的双等位基因功能缺失突变可导致类似JAM2的伴脑钙化综合征，其中JAM3-E116K变异不影响蛋白表达水平和亚细胞定位。RoseTTAFold结构预测显示，JAM2-R108H和JAM3-E116K两个突变均位于Ig样V结构域，破坏与其他氨基酸的极性及非极性相互作用，并改变蛋白表面电荷分布。细胞免疫沉淀实验证实，与野生型JAM2相比，JAM2-R108H突变蛋白无法与JAM3蛋白相互作用；JAM3-E116K突变同样显著影响JAM2–JAM3相互作用。这些结果表明R108残基对JAM2与JAM3间的结合至关重要。

**3.3 JAM2和JAM3在内皮细胞中共定位**

人鼠JAM2蛋白同源序列比对显示高度相似性(序列一致性79.19%)。实时PCR分析表明Jam2在小鼠脑中表达最高。3月龄小鼠的实时PCR、western blot和原位杂交分析显示JAM2在大脑广泛表达，以 cerebellum、脑干和丘脑区域水平最高，JAM3在相应脑区也高表达。双重原位杂交实验证实Jam2与血管内皮细胞标志物Pecam1共标，免疫荧光确认JAM2在内皮细胞(EC)中表达。此外，Jam2还表达于兴奋性和抑制性神经元、少突胶质细胞、周细胞和星形胶质细胞。JAM2和JAM3在MDCK.II细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)表面共定位。JAM2与JAM3在脑内皮细胞中的共定位提示其在PBC发病中的关键作用。

**3.4 JAM2缺失导致PBC样脑钙化、运动功能障碍和血脑屏障功能受损**

鉴于大多数JAM2突变为截短突变并导致蛋白功能丧失，研究人员利用CRISPR-Cas9技术构建了Jam2 KO小鼠模型，并确认了基因和蛋白水平的敲除。行为学测试结果显示，Jam2 KO小鼠在6月龄时转棒实验表现困难，9月龄时平衡木任务表现受损，表现出运动障碍表型；但6月龄和9月龄小鼠均未观察到认知功能障碍。组织学染色方面，12月龄Jam2 KO小鼠中脑出现von Kossa染色阳性的脑钙化沉积，并伴有显著的脑组织空泡化。伊文思蓝外渗实验显示，Jam2 KO小鼠脑实质中示踪剂浓度高于对照组，表明JAM2缺失导致小鼠BBB通透性增加。

**四、讨论与结论**

既往研究提出了PBC的两条主要致病途径：其一为颅内微环境磷酸盐稳态失衡(主要由SLC20A2和XPR1的功能研究支持)；其二为神经血管单元(NVU)和BBB损伤(由PDGFB和PDGFRB的功能研究初步提示)。所有8个已知PBC致病基因均表达于NVU内，其中JAM2主要表达于血管内皮细胞。本研究证明JAM2缺失导致BBB紧密连接结构破坏、通透性增加，可能促进局部钙磷沉积和成核，进而形成钙化。与MYORG突变损害星形胶质细胞磷酸盐代谢的机制不同，JAM2突变通过破坏BBB紧密连接完整性独立导致PBC样脑钙化和运动缺陷，提示PBC发病涉及NVU多种细胞类型和多条分子通路。

关于与Schottlaender团队Jam2 KO模型在脑钙化表型上的差异，可能与敲除设计(本研究采用CRISPR-Cas9双sgRNA敲除外显子2–5，而Schottlaender模型采用loxP策略靶向外显子5)、小鼠亚品系背景(C57BL/6JGpt vs. C57BL/6)、饲养条件、饮食、微生物状态及钙化检测方法(von Kossa染色 vs. H&E/PAS/Alcian blue)等差异有关。两模型均表现出中脑易感性、空泡化和运动功能障碍，表明JAM2功能缺失确实影响神经血管单元，而明显的矿物质沉积可能需要额外的修饰因素。

本研究存在以下局限性：(1) BBB损伤与钙化之间的直接机制联系尚未完全阐明；(2) 缺乏恢复JAM2–JAM3相互作用能否挽救BBB完整性的实验证据；(3) Jam2 KO模型不能完全模拟患者中单点突变的效果，需要构建JAM2-R108H敲入模型；(4) 未在相同实验条件下直接比较两种Jam2敲除系。

**研究结论**：本研究分析了两类PBC相关JAM2错义突变并确定所有已知突变均导致蛋白功能丧失。其中JAM2-R108H特异性破坏与JAM3的结合，JAM2–JAM3异二聚体相互作用的破坏损害紧密连接功能和BBB完整性，是JAM2-PBC的主要致病机制。Jam2 KO小鼠模型进一步证实了BBB损伤与脑钙化表型的关联。该研究支持NVU和BBB损伤是PBC核心致病机制的假说，并提示JAM2–JAM3相互作用可作为PBC及相关脑钙化疾病的潜在治疗靶点。该论文发表在《Brain Pathology》。