雌酮对雄性鳜鱼的内分泌干扰效应：从性腺重塑到基因调控

《The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology》：Endocrine Disrupting Effects of Estrone on Male Siniperca chuatsi: From Gonadal Remodeling to Gene Regulation

　　

# 摘要

雌酮（E1）是一种广泛存在的环境雌激素，对水生生物的生殖健康构成潜在威胁。为评估E1暴露对雄性翘嘴鲌（*Siniperca chuatsi*）性腺雌性化的诱导效应，将雄鱼暴露于0、0.01、0.1和1 μg/L的E1中60天。系统检测了E1暴露对翘嘴鲌血清性激素、性腺组织病理切片、vasa原位杂交、细胞凋亡及相关基因表达的影响。结果表明，0.1 μg/L E1处理显著抑制睾丸生殖细胞发育，而1 μg/L E1处理诱导80%的雄鱼性腺组织学雌性化，出现早期卵黄化的卵母细胞。此外，E1暴露导致血清性激素发生显著变化：11-酮基睾酮水平显著降低，而免疫反应性雌二醇水平显著升高。在E1诱导的组织学雌性化性腺中，vasa基因原位杂交呈阳性信号，TUNEL细胞凋亡检测未见明显凋亡信号。进一步的分子分析表明，性别调控和发育相关基因参与了E1介导的性腺雌性化过程：关键雄性性别决定基因（dmrt1、amh、gsdf、sox9）和类固醇生成支持基因（star、fshr）的表达显著下调，而关键雌性分化基因（bmp15、foxl2、cyp19a1a、hsd17b1）和生殖细胞发育基因（sox19a、dazl、vasa、ccne2、sox3）的表达显著上调。综上所述，这些发现表明E1暴露以剂量依赖方式诱导雄性翘嘴鲌睾丸的组织学雌性化，伴随雄性分化基因的转录下调和雌性分化基因的转录上调。

# 引言

雌酮（E1）、17β-雌二醇（E2）和雌三醇（E3）是由脊椎动物分泌的天然雌激素，在维持女性第二性征、调控生殖周期和维持内分泌稳态方面发挥关键作用。其中，E1是E2的主要代谢产物，可由17β-羟基类固醇脱氢酶催化转化而来，化学式为C??H??O?，广泛存在于妊娠尿液和水产养殖环境中[9]。在常见雌激素中，E1在水生环境中的浓度通常高于E2、E3和炔雌醇（EE2）[16]、[26]、[32]、[42]。具体而言，80%的E2可在水生生物作用下于20分钟内转化为E1[39]。在接收生活废水和畜牧废水的水域中，E1浓度可达1,250 ng/L[26]、[42]、[70]。此外，广东省珠江流域的E1浓度可达8.1 ng/L[17]。值得注意的是，即使在ng/L水平下，E1也表现出内分泌干扰效应，研究表明环境雌激素在低至1-10 ng/L的浓度下即可对鱼类产生不利影响，尤其是在早期生活史等敏感发育阶段[30]。

需要区分E1研究的两个目标。首先，就环境风险评估而言，本研究使用的浓度（0.01-1 μg/L，即10-1000 ng/L）跨越了环境相关水平范围。虽然最高浓度（1 μg/L）超过了典型环境浓度（通常为ng/L级别），但它可能与严重受污染的废水排放口或热点区域相关。然而，尚无野外调查报告显示环境浓度水平的E1在翘嘴鲌或其他鱼类中引起性腺雌性化，这可能与暴露时间、群体敏感性差异或野外环境的复杂性有关。其次，就水产养殖应用而言，有意使用较高浓度的E1以在可控的人工繁殖设置中实现高效的性腺雌性化。本研究侧重于这一人工诱导目标，使用对性别控制育种有效但不代表典型环境暴露场景的浓度（特别是0.1和1 μg/L）。研究结果应主要放在受控水产养殖诱导的背景下进行解读，而非直接预测环境风险。

关于E1的环境归趋，由于来自各种来源（如废水排放、农业径流）的持续输入，E1可在水体系统中持续存在。虽然E1可被进一步代谢，但半衰期相对较长（通常为数天至数周），且持续的环境输入维持了其存在[29]、[71]。目前关于雌激素的生态毒理学研究主要聚焦于合成雌激素（如EE2）的生殖毒性效应，而关于天然雌激素E1毒性机制的研究相对薄弱。

在不同鳜鱼类种群中，翘嘴鲌表现出最快的生长速率和最大的成体体型，是中国主要的养殖种群。根据《中国渔业统计年鉴》（2025），2024年中国鳜鱼年产量达到约47万吨，市场价值超过250亿元人民币（约35亿美元）。翘嘴鲌已被认定为高经济价值物种，市场价格通常在60至120元/千克（约8.5至17美元/千克），具体取决于地区和季节。关于生长表现，翘嘴鲌表现出生长性二态性。先前的研究证明，雌性翘嘴鲌在生长第2至第9个月期间生长速度显著快于雄性，而雄性在随后的第9至第14个月期间生长速度快于雌性[20]。雌性在早期生长阶段的优势对水产养殖生产具有重要意义。因此，培育全雄性单性养殖品系被认为是提高翘嘴鲌养殖产量的潜在策略。生产全雄翘嘴鲌需要通过性腺雌性化技术将遗传雄性（XY）诱导为表型雌性，产生假雌性（XY♀）[45]。这些假雌性对于单性育种计划至关重要——将其与正常雄性（XY♂）交配可产生YY超级雄性（理论上占后代的25%）。当这些YY超级雄性与正常XX雌性交配时，所有后代均为XY雄性，从而实现全雄性群体的大规模生产。该策略克服了直接性腺雌性化诱导无法建立遗传雄性种源的瓶颈，对于表现出显著生长性二态性的翘嘴鲌等物种尤为重要。该方法避免了与生殖相关的能量消耗，减少了由性别二态性引起的生长异质性，显著提高了整体养殖效率和产量[21]、[43]。

作为脊椎动物生殖系统的核心器官，性腺的发育和功能直接决定物种的繁殖成功率。鱼类的性别决定表现出独特的多样性和可塑性。与哺乳动物的决定性性别染色体系统不同，鱼类的性别大多是一种阈值性状，由多个基因位点调控，性别染色体和常染色体上的性别决定基因通过级联信号通路协同作用，引导原始性腺中未分化的原始生殖细胞（PGCs）定向分化为卵巢或睾丸[2]、[56]。性别分化是指性别决定后，未分化的原始性腺发育为卵巢或睾丸，个体表现出第二性征的一系列程序化事件[13]。在鱼类基因型性别相对稳定的前提下，不同物种的性腺分化过程对性类固醇激素的依赖性各不相同。性腺分化依赖于内源性性类固醇激素的鱼类对环境因素的变化更为敏感，其性别更容易受环境影响[69]。例如，在高温诱导下，某些胡瓜鱼科[77]、花鳉科[4]和慈鲷科[3]雄性比例较高，而在某些物种如欧洲海鲈（*Dicentrarchus labrax*）[58]和斑点叉尾鮰（*Ictalurus punctatus*）[57]中，雌性比例较高。先前的研究对翘嘴鲌的性腺发育进行了详细的组织学追踪分析。Liu等[41]发现原始生殖细胞在孵化后10天（10 dph）首次出现，随着性腺发育和性别决定的发生，卵巢在30 dph时出现初级卵母细胞和卵巢腔，而睾丸中则出现精原细胞。因此，可以认为翘嘴鲌在30 dph之前可能具有极高的性别可塑性。

内源性激素平衡是鱼类性腺分化的核心。在性别决定过程中，类固醇生成酶（P450scc、3β-HSD、P450c17）催化雄激素（T和11-KT）的合成，而芳香化酶（cyp19a1）将雄激素转化为E2，引导卵巢分化；在缺乏芳香化酶活性时，性腺发育为睾丸（Strussmann和Nakahara, 2002; Séralini等, 2001）。外源性激素通过干扰HPG轴破坏这种平衡，影响激素合成、受体结合或代谢[31]。基于此，本研究将翘嘴鲌（XY♂）暴露于不同浓度的E1中，系统评估E1暴露对雄性翘嘴鲌性腺雌性化的诱导效应。通过整合血清性激素分析、性腺组织病理学、vasa原位杂交、凋亡检测和生殖发育相关基因表达谱分析等多维度技术，本研究旨在评估E1驱动的翘嘴鲌性腺雌性化的效应及其潜在的分子应答机制，为培育假雌性翘嘴鲌种源和实现性别控制育种提供理论基础。

# 实验设置

本研究的实验用翘嘴鲌购自广州市南沙渔港产业园有限公司（广州南沙）。在实验室中，翘嘴鲌幼鱼（全长约0.8 ± 0.1 cm，孵化后10天）饲养在装有连续曝气去氯水（温度：28 ± 2 °C，溶解氧：6.3 ± 0.2 mg/L，pH：7.3 ± 0.2，光周期：14:10 h 光照/黑暗）的玻璃容器中，总氨氮控制在0.1 mg/L以下。

# 基因型雄性鱼类雌性化比例分析

经过60天E1处理后，分析E1暴露翘嘴鲌的性腺组织学及假雌性比例。使用M39和M46标记物鉴定基因型性别，性别鉴定部分结果见图S1。结果显示，在E1浓度为0.01、0.1和1 μg/L的处理组中均出现了假雌性（XY♀），而在0 μg/L对照组中未发现假雌性（XY♀）。各处理组间假雌性比例存在显著差异。

# E1诱导翘嘴鲌性腺雌性化的浓度依赖效应和表型特征

本研究证明，E1暴露以浓度依赖方式有效诱导雄性翘嘴鲌的组织学雌性化。在1 μg/L E1处理组中，80%的个体表现出卵巢样性腺结构，表明在组织学水平上发生了形态学雌性化；而在0.1 μg/L组中，仅39.1%的个体出现卵巢样结构，大多数个体表现出性腺发育抑制。这表明存在浓度依赖性效应。

# 结论

综上所述，本研究成功实现了E1诱导雄性翘嘴鲌性腺雌性化为假雌性。将雄鱼暴露于0、0.01、0.1和1 μg/L E1中60天后，我们发现E1以浓度依赖方式破坏了性别分化：0.1 μg/L E1导致睾丸生精上皮退化和生殖细胞减少，而1 μg/L E1诱导80%的雄性发生形态学雌性化，性腺发育为含有……的卵巢样结构。

# 伦理声明

本研究按照ARRIVE（活体动物实验报告）指南进行。本研究经广州大学生物伦理与生物安全机构审查委员会批准（批准号：GURBBB240405）。

# 伦理批准与参与同意

本实验的所有程序均于2024年4月5日获得广州大学生物伦理与生物安全机构审查委员会批准（批准号：GURBBB240405）。

# 资助

本研究由国家自然科学基金（批准号：32302995）、广东省基础与应用基础研究基金（批准号：2024A1515013176）和广州市高校（院所）与企业合作资助项目（批准号：2025A03J0022）资助。

# CRediT作者贡献声明

- **韩冲**：写作 – 审阅与编辑，监督，资金获取，概念化。
- **李强**：写作 – 审阅与编辑，监督，项目管理。
- **谢子航**：方法学，调查研究。
- **蔡国军**：可视化，方法学。
- **邓梓焱**：可视化，调查研究。
- **张永清**：验证，监督，项目管理，调查研究。
- **陈凯春**：写作 – 原稿撰写，验证，软件，形式分析，数据管理，概念化。
- **杨海英**：

# 利益冲突声明

作者声明，他们与本研究不存在利益冲突。作者声明，他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性经济利益或个人关系。

**作者**：陈凯春 | 张永清 | 李威斌 | 杨海英 | 邓梓焱 | 蔡国军 | 谢子航 | 李强 | 韩冲

**单位**：华南生物多样性研究中心，广州大学生命科学学院，广州，510006，中国