《Environmental DNA》：Temporal Replication and Sampling Efficiency in High-Frequency Autonomous and Manual eDNA Sampling
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环境DNA（eDNA）采样是生态学研究的重要工具，但其作为定量方法的可靠性可通过考虑eDNA浓度中无法解释的时空变异性和自相关性来提高。具有时间重复的采样设计可以分离采样变异与时间变异，但当样本顺序采集时，获取真正的时间重复较为困难。自动采样器可促进高频eDN
环境DNA（eDNA）采样是生态学研究的重要工具，但其作为定量方法的可靠性可通过考虑eDNA浓度中无法解释的时空变异性和自相关性来提高。具有时间重复的采样设计可以分离采样变异与时间变异，但当样本顺序采集时，获取真正的时间重复较为困难。自动采样器可促进高频eDNA采样，但其顺序采样结构引发了一个问题：在何种条件下，紧密间隔的样本可以合理地被视作时间重复。这项为期19.5天的研究在一个具有短期水文变异性的大型河流位点，评估了入侵性圆虾虎鱼（Neogobius melanostomus）eDNA浓度的时间变异。研究人员使用两台同步自动采样器和一个背包式采样器，以每15分钟一次的频率，使用聚醚砜（PES）或混合纤维素酯（MCE）滤膜采集样本。研究人员拟合了分解采样变异和时间变异的层次时间模型，在有效范围（effective range）的替代先验下评估了残差时间相关的证据，并使用模拟来评估将紧密间隔的顺序样本视为同步时间重复时的偏倚。研究人员发现了短滞后尺度上残差时间相关的证据，但时间相关的有效范围识别较弱且对先验假设敏感。在考虑时间结构后，水文协变量的解释支持有限。模拟表明，将在15–60分钟窗口内采集的顺序样本视为同步时间重复，会偏倚采样变异和时间变异的估计，尤其当时间相关相对较弱时。MCE滤膜比PES滤膜产生更高的预期回收拷贝数，而采样器类型之间的系统性差异证据较弱。这些结果强调，eDNA时间重复应尽可能在时间上紧密采集，并且在设计和分析高频eDNA调查时，应明确考虑时间相关的不确定性。
环境DNA（eDNA）采样时间重复性与采样效率的研究解读
一、研究背景与问题
环境DNA（eDNA）采样已从物种检测工具发展为能够提供生态过程定量见解的方法。然而，与所有生态采样工具一样，可靠的推断和研究设计优化需要理解所测量状态变量（通常是靶向eDNA方法中的eDNA浓度）的时空变异性和依赖性。eDNA浓度在水中表现出自相关性，即空间和时间上更接近的样本由于潜在环境和生物过程而更为相似。与从个体采样获得的生态数据相比，eDNA采样还受到与eDNA产生、运输和降解相关的额外自相关来源的影响。未能考虑这些时空依赖性可能导致参数估计偏倚和I型错误率膨胀，从而对生态过程和模式产生错误结论。
尽管空间变异性和相关性在eDNA研究中受到关注，但时间变异性和相关性相对研究不足。时间方差指位点真实eDNA浓度随时间的变化，由水文和/或生物动态驱动；采样方差则源于采集和后续处理过程中eDNA颗粒的随机捕获。时间相关描述邻近时间点浓度比远距离时间点更相似的程度，可能源于分钟到小时尺度的短期过程，或小时到天尺度的长期过程。在流动水域中，动态水文和生物过程可导致一个位点的eDNA浓度快速变化，时间相关对eDNA采样构成特殊挑战。例如，降水事件期间鱼类eDNA浓度出现小时尺度变化，鲑科鱼类eDNA浓度与产卵活动和成鱼状态相关的日和小时尺度变化均有报道。
同位点重复采样在eDNA研究中很常见，但将时间相关样本视为独立会导致伪重复，低估不确定性并膨胀I型错误率。具有时间重复的采样设计——在近似相同时间采集多个样本——可以分解采样和时间方差，并增加时间固定效应的统计功效。然而，在eDNA调查中进行时间重复的挑战在于难以在完全相同时间采集多个样本。手动技术引入秒到分钟的滞后时间，自动eDNA采样器通常顺序采集样本，每个样本需数分钟，导致重复间更长的滞后时间。一种潜在的获取时间重复的方法是将时间上紧密采集的样本视为同时采集。然而，只有当浓度在采集窗口内变化很小时，顺序样本才能合理近似时间重复。如果浓度在窗口内变化，将顺序样本视为同步会把部分时间变异归因于采样变异，偏倚方差分量估计。因此，评估短时间间隔内浓度变化率对于确定何时顺序样本可合理视为时间重复至关重要。
二、研究内容与结论
研究人员在纽约奥尔巴尼以北约13公里的哈德逊河美国地质调查局（USGS）测流站开展了一项为期19.5天的密集采样研究。该位点位于入侵性圆虾虎鱼（Neogobius melanostomus）从五大湖向哈德逊河流域扩张的前沿。研究人员使用两台同位同步自动采样器（Smith-Root）和一台手动背包式采样器（Smith-Root），在约1平方米范围内以最短15分钟的时间间隔采集样本。自动采样器使用一次性自保存5微米聚醚砜（PES）滤膜，背包样本分配在30个PES和30个混合纤维素酯（MCE）滤膜之间。在日间（1300）时段，研究人员在自动采样器首个和最后一个样本（1300和1345）同时采集三份背包样本。共计划采集自动采样器1和2各80个样本、背包60个样本。
研究人员构建了层次时间模型，将采样变异和时间变异分解，在有效范围的替代先验下评估残差时间相关的证据，并使用模拟评估将15分钟间隔的顺序样本视为同步时间重复时对方差分量估计的偏倚。研究发现短滞后尺度上存在残差时间相关证据，但时间相关有效范围（约3.56小时，95% CI: 0.57–48.62小时）识别较弱且对先验敏感。在考虑时间结构后，水文协变量（流量、浊度、电导率、温度）的解释支持有限。模拟表明，在15–60分钟窗口内将顺序样本视为同步时间重复会引入采样标准差的正偏倚（5.0%–69.5%）和时间标准差的负偏倚（?48.7%至?2.8%），当时间相关较弱时偏倚更大。MCE滤膜比PES滤膜具有更高的相对效率（后验概率0.99），而自动采样器与背包采样器之间的系统差异证据较弱。这些结果强调eDNA时间重复应尽可能在时间上紧密采集，并应明确考虑时间相关不确定性。该研究发表在《Environmental DNA》。
三、关键技术方法
现场采用两台自动采样器与一台手动背包采样器同步采样（研究团队在整合的采样支架上部署，确保所有样本在1平方米范围内）。实验室使用ReesCOI标记的定量PCR（qPCR）进行检测。数据分析采用层次贝叶斯时间序列模型，其中生态过程模型用多元正态分布（MVN）指数协方差函数建模时间相关，观测模型采用潜在拷贝框架处理qPCR复制、扩增失败和删失。模型用可逆跳跃马尔可夫链蒙特卡洛（RJMCMC）进行协变量选择，并用后验预测检验（PPCs）、混合预测检验（MPCs）和关键差异度量（PDMs）评估拟合优度。模拟研究通过在不同时间相关水平和突发采样间隔（0–1小时）下模拟数据集评估方差分量的偏倚。
四、研究结果
4.1 现场数据分析
共采集自动采样器1的78个、自动采样器2的80个和背包的60个样本，75%的技术重复观察到扩增。模型诊断显示考虑时间相关的模型更好地捕捉了数据的短滞后时间结构；不相关模型仅在0–1小时滞后范围显示残差自相关证据，而三个相关模型在所有滞后范围均无此证据。有效范围参数估计对先验敏感，最小95% CI下界为0.5小时，推断为现场数据最小时效范围。水文协变量的支持在相关模型中下降，电导率有弱到中等的支持。采样和时间标准差分别为0.40和0.63（对数尺度），表明两种变异源大小相当。效率比较未发现采样器间的明确差异，但MCE滤膜比PES滤膜回收效率更高。
4.2 模拟研究
当四个突发样本真正同时采集时，时间标准差和采样标准差的估计偏倚极小（≤2%）。随着突发间隔从0.25小时增加到1小时，采样标准差呈现5.0%–69.5%的正偏倚，时间标准差呈现?48.7%至?2.8%的负偏倚。时间相关较弱（有效范围3.56小时）时偏倚更显著；时间相关较强（有效范围48.38小时）时，15–30分钟间隔的偏倚可能可接受（绝对偏倚2.8%–7.2%）。这证实关键发现：将顺序样本视为时间重复的合理性取决于时间相关的强度。
五、讨论与结论
研究发现短程残差时间相关证据，但有效范围难以精确识别，无法确定该系统中避免显著偏倚的突发持续时间。在分解采样和时间变异为目标的研究中，顺序突发样本不应自动视为同步重复，应尽可能紧密采集时间重复或使用多个同步采样器。“近同步”eDNA采样不太可能有普遍定义，位点特定试点数据和基于模拟的敏感性分析可能是必要的。实际限制也影响“重复”的定义，自动采样器样本是数分钟过滤的积分，而抓取样本可在数秒内完成。高时间变异和采样变异与圆虾虎鱼的生态行为和位点动态水文一致。MCE滤膜效率高于PES滤膜可能归因于深度过滤与表面过滤机制差异。自动采样器与背包间的效率比较存在较大不确定性，部分归因于采样器和滤膜类型与时间变化的混淆。
研究结论表明，顺序自动采样突发提供时间重复的效用取决于eDNA浓度变化的时间尺度，强调解释高频eDNA数据时需考虑时间相关。将顺序样本视为同步会错误地将时间变异分配给采样变异，因此旨在分解方差分量的研究应尽可能在时间上紧密采集重复样本，可行时使用同步采样方法，并评估对合理时间相关情景的敏感性。更广泛地说，使用时间重复、比较采样方法或评估时间协变量的研究应考虑时间结构，评估对相关假设的敏感性，并认识到大的采样变异会限制识别生态驱动因素或证明方法间实际等效性的统计功效。
