利用可编程化学执行器实现酶催化的电化学控制

《Microchemical Journal》：Electrochemical control of enzymatic catalysis using programable chemical actuators

　　

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  展示了一种新型可编程化学致动器（PCA）。
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  PCA可逆地调控反应pH。
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  PCA通过碱性磷酸酶控制p-硝基苯基磷酸的去磷酸化。
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  PCA可应用于多种pH调控化学反应。

引言

酶促反应动力学对其环境的电化学组成高度敏感 [1]、[2]、[3]）。电化学历度可以通过使用移液器、泵或微流控电路添加或去除离子溶液来手动操控。这些方法难以放大并与其他技术集成，因为它们需要仔细监测以施加预设的电化学历度 [4]。利用光酸和光碱控制pH梯度并跟踪反应的光学方法 [5]、[6] 前景广阔，但由于需要清晰的光学路径、底物工程和/或蛋白质工程，并非与所有系统兼容 [2]、[4]、[7]。通常，酶催化的电化学操控需要将目标酶固定到电极表面，但许多酶无法以这种方式固定而不会受到显著损伤、动力学改变或完全失活 [8]。作为替代方案，可以使用介体在电极与可溶性酶的催化位点之间交换电荷，但该方法主要用于传感器而非动力学研究 [8]。最近的一篇报道成功通过计时安培法研究了可溶性酶葡萄糖氧化酶的动力学，使用了三电极化学池，其中包含未修饰的铂电极为工作电极、铂丝为对电极以及甘汞参比电极 [8]。尽管该方法在低酶浓度下非常灵敏，但它无法对质量传递速率进行精细控制。还表明，不同的溶剂可以改变反应驱动的致动机制，将离子交换从阴离子交换反转为阳离子交换 [9]。氧化石墨烯以及氧化石墨烯与碳糊混合制成的电极也常被用作药品及相关化合物的灵敏传感器 [10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]。

在本文中，我们提出了一种电化学方法，用于控制离体生化反应，驱动酶功能而非化合物检测，不受制药制造 [18]、食品加工 [19]、[20]、生物医学传感器 [21]、[22]、[23]、[24] 以及其他受环境浓度控制的新兴化学中当代方法局限性的约束。类似的方法已成功应用于调控Ficus elastica膜结合橡胶转移酶复合体的活性和聚合物分子量 [25]。迄今为止的研究通常利用高电位电解水，在阳极产生酸，在阴极产生碱 [26]、[27]、[28]、[29]。然而，水电解是有害的，因为极端的pH变化会使酶变性并导致细胞死亡 [29]。或者，贵金属电极可以通过在电极表面形成双电层来施加生物相容的电位 [30]。虽然这比手动添加/移除溶液更快且更具可重复性，但由于金属电极的电化学电容限制，可实现的离子浓度范围有限 [31]。金属电极有限的、7 pF/cm²的电容导致相应有限的电化学历度（公式S1）。

聚吡咯电极的电化学操作和表征是通过恒电位法进行的，其中控制电压驱动电流通过对电极，以实现导电聚合物工作电极与参比电极之间的预设电位差 [32]、[33]、[34]、[35]。电流响应在工作电极处测量，对应于聚合物的掺杂水平。电化学分析导电聚合物电极的方法包括循环伏安法、计时安培法和计时库仑法 [36]、[37]、[38]、[39]。

通过在金属电极表面合成导电聚合物，金属电极的电容可以增加至多300 F/cm³ [40]、[31]。合成导电聚合物最有效的方法是电氧化聚合，其条件可调聚合物的赝电容、稳定性和生物相容性 [41]、[42]。电氧化聚合将导电聚合物紧密粘附在电极上，可经历数千个氧化还原循环，并形成坚固的工作电极 [43]、[44]、[28]。在氧化还原循环期间，导电聚合物与溶液交换离子，并改变电化学池中工作电极与对电极之间控制体积内的离子浓度 [33]、[34]、[45]、[46]。影响溶液中离子浓度可以进一步用于控制酶催化活性。我们利用导电聚合物的这些特性，创建一种电化学器件，通过动态变化离子浓度来控制酶催化的生化反应。

在本研究中，我们提出了一种可编程化学致动器（PCA），即一种电化学池，其中通过还原和氧化导电聚合物工作电极来建立电化学历度（图1）。由此产生的离子驱动力（IMF）[34] 对电荷做功，导致聚合物与溶液之间交换离子（图1，蓝色和红色箭头）。重要的是要注意，术语"化学致动器"不应与由化学刺激驱动的机械致动混淆，而是指影响封闭体积内的离子浓度。聚合物掺杂剂、聚合物平衡溶液、施加的电压波形、电极位置和聚合物电容可调工作电极与对电极之间的电化学历度，以满足预设的离子选择性、IMF分布和IMF幅值约束。

PCA相比旧方法（包括别构调控、共价修饰、蛋白水解切割，或改变整体溶液环境如pH，或添加抑制剂或激活剂）提供了显著进步。PCA可以独特地利用双脉冲安培法，通过电信号提供对酶活性的实时、高度局部化、可逆且可调的控制。涉及整体变化的方法会影响系统中的所有酶，通常不可逆，并且依赖较慢的扩散过程。此外，尽管非PCA检测和控制系统从实验室到工业过程被广泛使用，但PCA非常适合需要精确、动态控制的微流控、生物传感器或潜在可植入器件等应用。其他对酶活性实施高级控制的器件包括有机电子离子泵 [47]、[48]、基于DNA的化学控制器 [49] 以及对外部刺激响应的纳米材料固定酶 [50]。

表征IMF的结果被用于探索可溶性酶碱性磷酸酶的生物电子控制。本研究选用碱性磷酸酶，因为碱性磷酸酶超家族中的磷酸酶、硫酸酶和磷酸二酯酶均表现出pH依赖性动力学 [51]、[52]、[53]。去磷酸化机制在细菌和真核碱性磷酸酶之间是保守的，但产物和无机磷酸盐的生理功能在不同生物体和组织间有所不同 [51]、[52]、[53]、[54]、[55]。碱性磷酸酶超家族成员间的功能相互关系表明，对碱性磷酸酶实现生物电子控制成功的方法可能在各种酶和生物体中广泛适用。

章节摘要

实验部分

除另有说明外，本研究中使用的所有材料和试剂均购自MilliporeSigma。

导电聚合物掺杂剂与平衡决定离子选择性

阴离子致动器通过用氯离子掺杂聚吡咯并经500 mM NaOH循环平衡（使用循环伏安法）制备。在还原过程中施加到体积大且不可移动的聚合物上的负电位迫使氯离子（以及此类系统中的任何其他小分子可移动阴离子）离开聚合物。此过程通常被称为阴离子交换掺杂/去掺杂机制。此外，聚吡咯骨架上离域的正电荷在很大程度上阻止了

结论

PCA架起了电子控制与化学操控之间的桥梁，提供了一种按需、可电调的酶动力学平台，这是传统基于溶液或生物学调控方法无法实现的。我们报告了一种有效的可编程化学致动器，解决了以往方法利用离子浓度作为酶反应控制变量的局限性。可编程化学致动器通过以下方式控制电化学历度

作者贡献声明

J. Parker Evans

Evans完成了本文中报告的研究，制作了图表并起草了初稿。

Sriram Satagopan

Satagopan完成了当前工作所基于的初步研究，指导Evans如何制作和操作致动器，参与了实验设计，并审阅了论文的初稿。

Vishnu Baba Sundaresan

Sundarensan构思了本研究，指导Evans进行他的研究，并对初稿的最终撰写和解释进行了

资金来源

本工作获得了NSF CAREER项目 #1055311 的资助，以及俄亥俄州立大学应用植物科学中心转化植物科学研究生项目的博士奖学金资助，感谢工程学院机械与航空航天工程系。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些关系可能影响本文所报告的工作。

致谢

作者感谢他们的各位实验室同事以及Evans博士的学业顾问委员会在本研究进行期间的支持。

John Parker Evans|Sriram Satagopan|Vishnu Sundaresan|Katrina Cornish