整合蛋白质组学与基因组学方法鉴定人类滋养层发育过程中的关键蛋白激酶

《The FASEB Journal》：An Integrated Proteomics and Genomics Approach to Identify Essential Protein Kinases During Human Trophoblast Development

　　

在发育中的人类胎盘中，三种亚型的滋养层细胞——细胞滋养层细胞（CTBs）、绒毛外滋养层细胞（EVTs）和合体滋养层细胞（STBs）——介导对成功妊娠至关重要的关键功能。CTBs构成干细胞/祖细胞区室，并分别在游离绒毛和锚定绒毛中分化为STBs和EVTs。STBs建立母胎交换界面并分泌人绒毛膜促性腺激素（hCG），这是一种对维持早期妊娠至关重要的激素。EVTs锚定母体子宫内膜并侵入子宫组织以重塑母体细胞，支持胚胎着床和妊娠进程。在本研究中，研究人员使用人类滋养层干细胞（hTSCs）作为模型系统，并进行定量、无标记液相色谱–串联质谱（LC–MS/MS）分析，以描绘TSC干细胞状态（类似于未分化CTBs）及其分化为STBs和EVTs后的蛋白质组和磷酸化蛋白质组。通过多组学方法，研究人员将蛋白质组学数据与全局基因表达谱相整合，以关联人类滋养层发育过程中细胞类型特异性的基因和蛋白质表达。研究人员还鉴定了全局磷酸化蛋白质组，并分析了在hTSC干细胞状态以及分化的STBs和EVTs中特异性激活的激酶。研究人员通过实验验证了特定激酶，如BUB1B、PAK6、PKMYT1和TNIK，对于维持hTSC干细胞状态是必需的。此外，非典型蛋白激酶C亚型PKCζ对于STB发育至关重要，而PTK2B、SRC、TRIO和LYN则对EVT发育具有重要意义。研究人员的发现突出了在人类胎盘形成过程中滋养层发育特定阶段独特需要的關鍵激酶，并提示这些激酶的药理学抑制可能对妊娠期间的胎盘形成过程产生负面影响。

**人类滋养层发育的整合蛋白质组学与基因组学研究解读**

**一、研究背景与意义**

正常胎盘发育是确保妊娠成功的关键前提。胎盘虽是暂时性器官，但承担着为发育中胎儿输送氧气和营养物质、以及通过内分泌功能促进母体适应以维持妊娠延续等多重功能，这些功能主要由滋养层细胞谱系介导。在人类胎盘发育过程中，细胞滋养层细胞（CTBs）构成干细胞/祖细胞区室，在两类胎盘绒毛中采用两种分化命运：在游离绒毛中，CTBs分化为多核合体滋养层细胞（STBs），直接接触母血并充当气体和营养交换界面，同时提供屏障功能以保护胎儿免受感染和毒性物质侵害；在锚定绒毛中，CTBs则采用侵袭性分化命运，形成侵袭性绒毛外滋养层细胞（EVTs），锚定母体子宫内膜并重塑子宫动脉以建立满足胎儿营养需求的低阻力血管。因此，三种滋养层亚型具有截然不同的生物学特征：CTBs的自我更新与分化平衡、STBs的细胞融合与转运功能、EVTs的侵袭与血管重塑功能。

既往大量转录组学、基因组学和表观基因组学研究已为人类滋养层发育过程中的基因调控动态提供了重要见解，但尚未有研究采用整合方法将基因表达与蛋白质组和磷酸化蛋白质组相关联，以理解不同滋养层亚型中信号通路的动态变化。虽然有研究对小鼠胎盘形成过程中的蛋白质组、磷酸化蛋白质组和转录组进行了整合分析，但小鼠与人类之间的滋养层发育存在根本性差异。因此，本研究利用无标记LC–MS/MS技术，对人类滋养层干细胞（hTSCs）在干细胞状态及其分化为STBs和EVTs后进行全局蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析，并整合基因表达数据以系统鉴定调控滋养层发育各阶段的关键蛋白激酶。

**二、主要技术方法**

本研究采用的主要技术方法包括：利用CT27 hTSC细胞系（由日本东北大学Hiroaki Okae博士惠赠），在干细胞状态及STB/EVT分化条件下培养；采用无标记液相色谱–串联质谱（LC–MS/MS）结合Orbitrap Ascend质谱仪和FAIMS进行全局蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析；利用TiO₂和Fe-NTA富集试剂盒进行磷酸化肽段富集；整合全局RNA-seq数据和已发表的第一孕期人胎盘单细胞RNA-seq（scRNA-seq）数据（GEO accession GSE145036）；使用KinHub数据库和RokaiXplorer计算工具鉴定激酶活性；使用MTT法测定抑制剂工作浓度，并通过激酶抑制剂处理进行功能验证。

**三、研究结果**

**3.1 鉴定人类滋养层细胞类型中独特表达的蛋白质**

研究人员利用Orbitrap质谱仪对CT27 hTSCs干细胞状态及分化为STBs和EVTs后的蛋白质组进行了高分辨率分析，通过HLA-G（EVT标志物）和hCG-β（STB标志物）验证了分化命运。全局蛋白质组分析共鉴定出393,059条肽段序列，对应4911个蛋白质。经与第一孕期人胎盘scRNA-seq数据整合分析，鉴定出19个仅在未分化hTSCs中表达的蛋白质、6个仅在STBs中表达的蛋白质和8个仅在EVTs中表达的蛋白质。hTSCs中独特表达的蛋白质涉及DNA复制、细胞周期和细胞分裂（GMNN、POLA1、POLE、NUSAP1等）以及细胞黏附和细胞外基质功能（DSG3、FBN2、MPP2等）。STBs中独特表达的NECTIN3、NECTIN4和PCDH1参与细胞黏附调控。EVTs中独特表达的ARHGEF16是Rho家族GTPase的鸟嘌呤核苷酸交换因子。

**3.2 整合全局基因和蛋白质表达以鉴定hTSC分化过程中的差异表达蛋白质**

通过整合RNA-seq和蛋白质组学数据进行分析，研究人员发现以1.5倍为变化阈值，在STB分化过程中有835个基因在RNA和蛋白质水平均上调、1044个基因均下调；在EVT分化过程中有712个基因均上调、889个基因均下调。许多已知的STB标志物（CGA、PSG9、ENDOU）和EVT标志物（HLA-G、ERBB3、TEAD3）的蛋白质表达在分化后显著上调，而参与细胞周期调控（CDK1、MKI67）和hTSC自我更新（YAP1）的蛋白质则强烈下调。基因集富集分析表明，STB和EVT发育过程中与细胞周期、有丝分裂和染色体分离相关的蛋白质均下调，而与免疫应答和抗病毒防御相关的蛋白质均被诱导。GO分析显示STB发育与细胞转运和mTOR信号等营养感应机制相关，EVT发育则与泛素-蛋白酶体和溶酶体/自噬性蛋白质分解代谢、碳水化合物代谢及干扰素应答相关。此外，研究人员发现STB和EVT分化均伴随细胞类型特异性的自噬相关蛋白质诱导，提示自噬可能是调控滋养层发育的基本机制。

**3.3 定义人类滋养层分化过程中的磷酸化蛋白质动态变化**

研究人员共鉴定出12,355条磷酸化肽段，其中超过80%为单磷酸化、15.8%为双磷酸化、3.7%具有多于2个磷酸化位点。磷酸化位点中91.2%为磷酸化丝氨酸（S）、8.5%为磷酸化苏氨酸（T）、0.3%为磷酸化酪氨酸（Y）。共在三种滋养层细胞类型中鉴定出2251个磷酸化蛋白质，其中1709个为三种细胞类型共有，165个仅在hTSC干细胞状态中表达，21个和49个分别在STBs和EVTs中特异性表达。成对比较分析鉴定出hTSC向STB分化过程中的54个差异积累磷酸化位点和hTSC向EVT分化过程中的81个差异积累磷酸化位点。GSEA分析显示两种分化过程中的差异磷酸化均抑制细胞周期和有丝分裂，而STB发育的差异磷酸化激活细胞-细胞黏附过程，EVT发育的差异磷酸化则强激活细胞运动相关过程。此外，许多已被CRISPR筛选鉴定为干细胞状态维持的关键调控因子（ARID3A、GATA3、EGFR等）在hTSCs中均被磷酸化。

**3.4 鉴定人类滋养层发育过程中的活性蛋白激酶**

研究人员利用KinHub数据库的人类激酶组信息和RokaiXplorer计算工具分析磷酸化蛋白质组数据，并通过scRNA-seq数据验证活性激酶在发育中人类胎盘中的表达。在未分化hTSCs中活性最高的激酶包括参与细胞周期进程和增殖的CDK1、CDK5、CDK6和AURKA，以及参与应激和炎症信号通路的MAPK13。选择性在未分化hTSCs中高活性的激酶包括PKMYT1（负调控G2/M转换）、BUB1B（有丝分裂检查点激酶）、PAK6（p21激活的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶）和TNIK（WNT信号通路激活因子），scRNA-seq分析确认这些激酶的mRNA在早期发育胎盘的未分化CTBs中高度富集。在STBs中选择性高活性的激酶包括BRAF、PDPK1和非典型蛋白激酶C亚型PKCζ，以及酪蛋白激酶2亚基（CSNK2A1、CSNK2A2、CSNK2B）。在EVTs中选择性高活性的激酶包括SRC、PTK2B（也称PYK2）、TGFBR2、LYN和TRIO。此外，AKT1、ERBB2、ERBB3、RAF1和TBK1在STBs和EVTs中均表现活性。

**3.5 检测激酶在hTSCs中的功能重要性**

研究人员使用选择性药理学抑制剂对鉴定出的关键激酶进行功能验证。通过MTT法和Annexin-V/FITC凋亡检测优化了工作浓度，选择维持>80%细胞活力的剂量进行后续实验。

抑制PAK6（GNE2861）、TNIK（Rentosertib）、BUB1B（ATA180）或PKMYT1（Lunresertib）均显著损害hTSC增殖，表现为细胞生长减少和Ki67表达降低。通过检测下游效应分子验证了各抑制剂的靶向效果：GNE2861抑制ERK1/2磷酸化（PAK6下游信号）、Rentosertib抑制cMYC表达（TNIK介导的Wnt/β-catenin信号）、ATA180降低pH3S10水平（BUB1B依赖的有丝分裂信号）、Lunresertib消除CDC2 Tyr15抑制性磷酸化（PKMYT1的直接底物）。干细胞状态调控因子CDH1、CCNA2和TEAD4的表达在各激酶抑制后均显著降低。形态学上，PAK6抑制诱导侵袭性细胞突起（类似早期EVT分化），BUB1B抑制产生扁平集落并伴有CDH1表达降低和STB标志物CGB的诱导（提示向STB样命运适应），TNIK或PKMYT1抑制则产生混合的侵袭性和扁平形态。

aPKCζ抑制剂Go6983在干细胞状态下不影响hTSC增殖和干细胞状态维持，但严重损害STB分化。Go6983处理后细胞在STB分化条件下维持干细胞样形态，并保持CDH1、TP63和TEAD4的高水平表达，而STB标志物ERVW1、SDC1和CGB的诱导被显著抑制。Western blot确认Go6983处理抑制了aPKCζ Thr410磷酸化。

在干细胞状态下，TRIO抑制剂ITX3和LYN抑制剂Bafetinib不影响hTSC增殖或干细胞维持，而SRC抑制剂SKI1和PTK2B抑制剂PF-4618433部分减少hTSC增殖。然而，在EVT分化条件下，四种激酶抑制剂均强烈损害EVT分化，表现为细胞形态缺陷和突起生长减少，Bafetinib处理的细胞形态异常并出现凋亡增加。抑制SRC或LYN均降低磷酸化SRC家族Tyr416信号水平。EVT标志物HLA-G和NOTUM在激酶抑制后诱导效率显著降低。仅TRIO抑制时TEAD4表达显著上调，提示TRIO抑制可能将细胞阻滞在干细胞样状态。

**四、讨论与结论**

hTSC培养模型在很大程度上重现了发育中人类胎盘原代滋养层细胞的基因表达程序，是研究滋养层谱系发育和功能的宝贵模型。本研究通过整合蛋白质组学和基因组学方法系统鉴定了人类滋养层发育过程中的蛋白质表达动态，结合磷酸化蛋白质组学和scRNA-seq数据建立了严格的平台来鉴定决定滋养层细胞特异性功能的活性激酶，并通过实验验证了特定激酶在hTSC干细胞维持和STB/EVT分化中的必要性。

在未分化hTSCs中，全局蛋白质组、磷酸化蛋白质组和激酶活性主要指示参与细胞周期进展和有丝分裂的蛋白质和激酶。研究还发现hTSCs中独特表达一组参与细胞黏附（DSG3）和细胞外基质调控（FBN2、MPP2）的蛋白质，其在CTBs中的功能意义尚待阐明。TNIK抑制导致hTSC同时出现STB样和EVT样形态适应，PAK6抑制诱导迁移表型，PKMYT1和BUB1B抑制导致向STB样集落形态转变，提示这些激酶在CTB祖细胞中的功能可能阻止过早适应STB和EVT命运，从而平衡滋养层发育以实现正常胎盘形成。

在STB发育方面，aPKCζ在STB中高表达且Go6983抑制后STB分化受阻，结合此前报道的aPKCλ/ι遗传耗竭抑制STB分化，表明非典型PKC亚型在STB发育中发挥重要作用。研究人员预测PI3K-PIP3-PDPK1-aPKCζ信号轴对STB发育至关重要。STB中特异性表达的RIPOR2可能通过与RHO蛋白结合调节细胞极性，对STB的定向转运功能具有潜在意义。

在EVT发育方面，研究观察到与干扰素/抗病毒反应相关的蛋白质（OAS1、OAS2、IFIT2、IFIT3、IFIH1）被诱导表达，其机制可能与内源性逆转录病毒元件的选择性表达增强有关，也提示LYN激酶的诱导和活性可能通过磷酸化NLRP3抑制炎症小体形成，与干扰素反应基因的诱导存在关联。TGFBR2是EVT中最丰富的激酶之一，但EVT发育还依赖于SRC、PTK2B和TRIO的功能，PTK2B和TRIO的缺陷可能导致上皮-间质转化（EMT）调控因子活性和细胞侵袭机制受损。

本研究鉴定出许多细胞类型特异性激酶，同时也发现一些激酶在多种细胞类型中同时激活，如MAPK家族成员在hTSC和EVT中均表现活性，AKT1、ERBB2和ERBB3在STB和EVT中均表现活性。同一激酶家族的不同成员可在不同滋养层细胞中选择性表达，如SGK3在CTB祖细胞中选择性诱导而SGK1在STB中选择性诱导，EPHB4在STB中高活性而EPHB3在EVT中高活性。

本研究的发现具有重要的转化医学意义。许多鉴定出的激酶正处于肿瘤学治疗靶点的活跃研究中，且已有高选择性小分子抑制剂开发。然而，研究数据表明这些激酶在正常人类胎盘形成过程中也执行必需的谱系特异性功能，这提示在妊娠期间使用激酶靶向治疗时需要谨慎。同时，定义控制滋养层干细胞维持和谱系特化的激酶信号网络，为识别高危妊娠中的失调通路提供了框架，可能有助于开发旨在恢复而非抑制滋养层信号通路的精准治疗策略。随着胎盘靶向药物递送技术的进步，选择性调节疾病相关激酶通路最终可能为改善胎盘功能同时最小化胎儿暴露提供新机会。