超生理剂量25-羟基维生素D3与卡泊三醇诱导HeLa宫颈癌细胞活性氧、线粒体功能障碍与凋亡

《FASEB BioAdvances》：Supraphysiological 25-Hydroxyvitamin D3 and Calcipotriol Induce Reactive Oxygen Species, Mitochondrial Dysfunction and Apoptosis in HeLa Cervical Cancer Cells

　　

宫颈癌仍然是全球重大健康挑战，需要持续推进治疗策略的发展。新出现的证据表明，维生素D衍生物可能发挥抗癌作用，包括诱导凋亡，可能通过氧化还原依赖性机制。本研究探讨了维生素D暴露是否与宫颈癌细胞中活性氧（ROS）蓄积、线粒体功能障碍和凋亡相关。研究人员将HeLa细胞暴露于生理、中间和超生理浓度的25-羟基维生素D₃，以及卡泊三醇（一种1,25-二羟基维生素D类似物）。细胞活力测定（结晶紫、Alamar Blue和Muse细胞活力）显示剂量依赖性活力降低。流式细胞术分析显示凋亡标志物增加，表现为Annexin V结合和caspase-3/7激活。氧化应激测定显示ROS阳性细胞群增多，伴随线粒体膜去极化。在最高有效浓度下，过氧化氢酶和总超氧化物歧化酶活性降低。同时，MAPK、PI3K/AKT和NF-κB促生存通路中蛋白质总表达量下降。这些细胞变化伴随通过PlasDIC和明场显微镜观察到的凋亡形态学特征，包括膜出泡、核碎裂和凋亡小体形成。总之，这些发现表明，在超生理剂量维生素D暴露后，氧化还原紊乱、线粒体功能障碍和凋亡同时发生。NAC联合处理部分减弱了ROS阳性细胞群，并在卡泊三醇处理后改善了平均活力，支持ROS可能参与卡泊三醇相关的细胞毒性；然而，本实验并未确定ROS是凋亡的必要介导因素。

**超生理剂量维生素D代谢物诱导HeLa宫颈癌细胞氧化还原紊乱、线粒体功能障碍与凋亡的机制解读**

宫颈癌仍是全球女性第五大常见恶性肿瘤，2024年估计新发病例约60.4万例，死亡约28万例。高危型人乳头瘤病毒（HPV）持续感染，尤其是HPV16和HPV18型，是宫颈癌发生的必要病因学驱动因素。当前治疗以手术、放疗和铂类化疗为主，但晚期、复发和转移性宫颈癌常因内在或获得性耐药而导致治疗失败。因此，寻找能够选择性激活宫颈癌细胞死亡通路且全身毒性较低的药物，成为该领域持续关注的重点。维生素D及其衍生物因具有调节分化、增殖和凋亡的潜在能力而受到关注。循环中的25-羟基维生素D₃[25(OH)D₃]是维生素D状态的主要临床生物标志物，可通过维生素D受体（VDR）发挥信号作用。许多上皮来源的癌细胞，包括宫颈癌细胞系，同时表达VDR及维生素D代谢酶CYP27B1和CYP24A1，构成局部自分泌维生素D代谢系统（VDMS），可将循环中的25(OH)D₃转化为活性激素形式，无需肾脏1α-羟化酶参与。已有研究表明，超生理浓度的25(OH)D₃可通过VDR依赖性、CYP27B1介导的信号通路抑制HeLa和SiHa宫颈癌细胞生长并诱导凋亡。然而，活性激素1,25(OH)₂D₃（骨化三醇）在体内因需超生理剂量而导致高钙血症等限制。为此，低钙血症倾向的合成类似物如卡泊三醇被开发出来，以保留抗增殖和促凋亡活性。肿瘤细胞的命运受活性氧（ROS）水平的影响，ROS蓄积超过抗氧化能力时可触发线粒体膜去极化和caspase激活等凋亡程序。但ROS是否在宫颈腺癌HeLa细胞中介导维生素D代谢物的凋亡作用，此前尚未在跨越阈值至最大有效剂量的浓度范围内得到系统验证。针对上述问题，研究人员开展了本研究。

本研究采用了美国典型培养物保藏中心（ATCC）来源的HeLa宫颈腺癌细胞系（CCL-2）。主要技术方法包括：Alamar Blue代谢活性测定、结晶紫相对细胞数定量、Muse细胞分析仪进行细胞活力、Ki67增殖、ROS、线粒体膜电位、Annexin V凋亡及caspase-3/7活性检测；总超氧化物歧化酶（T-SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性测定；乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测；Western blot检测PI3K/AKT、MAPK和NF-κB通路蛋白总表达水平；PlasDIC和H&E染色形态学观察；以及N-乙酰半胱氨酸（NAC）联合处理实验。所有实验均包含三次生物学重复和技术重复，数据以均值±标准误表示，采用单因素方差分析进行统计检验。

研究结果分述如下：

**3.1 卡泊三醇和25(OH)D₃浓度依赖性抑制HeLa细胞生长**
通过生长抑制曲线、Muse细胞活力、Alamar Blue和结晶紫实验发现，10 μmol/L 25(OH)D₃导致71%的生长抑制；150 μmol/L以上卡泊三醇出现超过100%的抑制。10 μmol/L 25(OH)D₃、200和250 μmol/L卡泊三醇显著降低细胞活力，结晶紫检测显示相对细胞数呈浓度依赖性下降，而Alamar Blue仅在250 μmol/L卡泊三醇时显著降低，提示代谢活性与细胞生物量之间可能存在解偶联。

**3.2 Ki67增殖不受处理影响**
Ki67染色显示，所有处理组的增殖阳性比例与未处理对照相比均无显著差异，表明观察到的细胞减少并非单纯由增殖抑制引起。

**3.3 25(OH)D₃和卡泊三醇增加ROS阳性细胞和线粒体膜去极化**
流式细胞术检测发现，10 μmol/L 25(OH)D₃将ROS阳性细胞比例显著增加至17.54%，250 μmol/L卡泊三醇增加至30.96%。同时，5和10 μmol/L 25(OH)D₃以及150和250 μmol/L卡泊三醇均显著引起线粒体膜电位去极化。由于这些终点同时检测而非时间序列分析，无法确定ROS蓄积是否先于线粒体去极化。

**3.4 维生素D处理降低T-SOD和CAT活性并增加LDH细胞毒性**
在最高有效浓度下，T-SOD活性在250 μmol/L卡泊三醇时显著降低；CAT活性在10 μmol/L 25(OH)D₃和250 μmol/L卡泊三醇时显著降低。LDH释放实验显示，10 μmol/L 25(OH)D₃引起轻度但显著的LDH增加，150和250 μmol/L卡泊三醇则诱导更明显的细胞毒性。

**3.5 超生理剂量处理增加总凋亡细胞群并出现凋亡形态**
Annexin V实验显示，5和10 μmol/L 25(OH)D₃、150和250 μmol/L卡泊三醇均显著增加总凋亡细胞比例；caspase-3/7活性在10 μmol/L 25(OH)D₃及150、250 μmol/L卡泊三醇时显著升高。PlasDIC和H&E染色观察发现，超生理剂量处理组出现细胞密度降低、细胞皱缩和圆缩、膜出泡、核碎裂及凋亡小体形成等典型凋亡形态特征，且半定量分析显示这些形态变化具有浓度依赖性。

**3.6 MAPK、PI3K/AKT和NF-κB信号通路下调**
Western blot结果显示，超生理浓度25(OH)D₃和卡泊三醇显著降低AKT、mTOR、GRB2、ERK、IκBα和p65蛋白的总表达水平；GI50浓度（35 μmol/L卡泊三醇）的验证实验亦复现了这些通路蛋白的下调。

**3.7 GI50浓度下NAC联合处理的影响**
在24小时GI50实验中，9 μmol/L 25(OH)D₃未显著改变ROS阳性比例或细胞活力。35 μmol/L卡泊三醇显著降低细胞活力并增加ROS阳性细胞群，而500 μmol/L NAC联合处理后细胞活力数值升高、ROS阳性群均值下降，但差异未进行直接的组间统计比较，且未检测凋亡和线粒体终点，因此仅能提示部分减弱而非确证ROS介导的凋亡。

讨论指出，超生理剂量的25(OH)D₃和卡泊三醇可诱导HeLa细胞发生与氧化还原紊乱、线粒体膜去极化和凋亡相关的多参数改变，但实验设计尚不能证明ROS是凋亡的必要驱动因素，也不能确定事件发生的先后顺序或凋亡是否特异性地通过内源性线粒体途径执行。信号通路蛋白的总量下降支持促生存信号的丢失，但未通过磷酸化检测或核转位分析来确定通路激活状态。本研究结论翻译如下：超生理剂量25(OH)D₃和卡泊三醇在HeLa细胞中诱导ROS蓄积或氧化还原紊乱、线粒体膜去极化、抗氧化酶活性降低和凋亡性细胞死亡。这些发现表明治疗后氧化还原紊乱、线粒体功能障碍和凋亡同时发生。在24小时GI50实验中，NAC联合处理与卡泊三醇暴露后ROS阳性细胞群的部分减弱以及更高的平均细胞活力相关，支持ROS可能对卡泊三醇相关细胞毒性有贡献。然而，由于未评估抗氧化剂对线粒体和凋亡终点的挽救作用，当前结果不能确定ROS是凋亡所必需的，也不能证明凋亡特异性地通过内源性线粒体途径进行。Ki67表达保持阳性，同时伴有阳性的生化和形态学凋亡标志物，支持以细胞毒性作用为主而非单纯的细胞抑制。尽管所需超生理浓度超过临床可达到的水平，这些数据为后续深入研究维生素D代谢物在宫颈癌细胞中的氧化还原调节机制提供了基础。该论文发表于《FASEB BioAdvances》。