《COMPREHENSIVE REVIEWS IN FOOD SCIENCE AND FOOD SAFETY》：Revisiting the PCR-Based Molecular Approaches for Mycotoxigenic Fusarium Species Detection and Quantification in Wheat
镰刀菌（Fusarium）种类通过引发赤霉病（FHB）及相关受管制真菌毒素（如单端孢霉烯族化合物和玉米赤霉烯酮）的污染，导致小麦生产产量损失。尽管基于PCR的分子方法在镰刀菌检测、定量和化学分型中被广泛应用，但大多数引物是在现代系统发育重分类和高通量基因组组装数据可用之前开发的，其特异性和稳健性在很大程度上未经验证。研究人员利用精选基因组panel对现有用于小麦镰刀菌检测的PCR和qPCR检测方法进行了综述和计算机模拟（in silico）再评价。在53对物种特异性引物中，14对（26.4%）获得高特异性等级（A–B），而25对（47.2%）表现较低（D–E），主要原因是交叉反应或目标扩增不一致。靶向TRI和ZEN基因的化学型检测方法与已报道的化学型表现出较强的一致性，尤其是对TRI基因座中信息量较大的Tri3、Tri7和Tri12。为支持改进qPCR检测设计及报告规范，研究人员提出FusaMIQE——一种基于MIQE 2.0指南的镰刀菌适应性框架，针对小麦中镰刀菌诊断的特殊挑战进行了定制。综上，本研究首次对PCR/qPCR引物作为FHB病原体诊断工具进行了计算机模拟评估，并提出了小麦镰刀菌诊断的良好实践建议（FusaMIQE）。
基于现代基因组资源对PCR/qPCR引物进行计算机模拟再评价的研究背景与意义
全球小麦产量在2023/24年度估计为7.87亿吨。镰刀菌赤霉病（FHB）仍然是小麦生产中最显著的威胁之一，在流行年份可造成10%–70%的产量损失。除减产外，FHB尤为值得关注，因为感染会降低籽粒品质和可销售性。此外，相关真菌毒素可能限制其作为食品、饲料和加工原料的适用性，对人类和动物健康构成严重风险，并在欧盟及全球范围内受到严格监管。与许多由单一物种引起的真菌病害不同，FHB是一种涉及多种镰刀菌物种的复杂病害，多达17个系统发育上不同的物种参与侵染，每个物种在致病性和产毒潜力上各有差异。
镰刀菌属包含一个庞大且分类学上复杂的丝状真菌类群，涵盖植物病原菌、内生菌、腐生菌和机会性动物病原菌。早期的分类主要基于形态学，识别了数百至上千个推定物种，但对进化关系的认识有限。近年来，多位点及全基因组系统发育学重塑了这一图景，表明该属包含超过400个物种，归属于得到良好支持的物种复合群。聚合酶链式反应（PCR）的发展革新了镰刀菌检测方法。过去25年间开发了多种不同类型的基于PCR的分子标记。早期分子检测通常依赖于随机扩增多态性DNA（RAPD）标记，后来转化为序列特征化扩增区域（SCAR）标记以提高可重复性。值得注意的是，许多早期基于PCR的检测方法是在基因组资源有限的情况下开发的，并与当时主流的基于形态学的分类体系保持一致。在大多数情况下，PCR产物未经测序，检测特异性在很大程度上未在序列水平上得到验证。因此，当依据现有基因组资源进行评估时，其特异性和稳健性仍存在不确定性。
尽管存在这些局限性，数十年前报道的众多镰刀菌特异性遗留引物仍在普遍使用。例如，1998年开发的Fg16F/Fg16R引物对继续被广泛用于区分禾谷镰刀菌与其他镰刀菌物种。定量PCR（qPCR）的后续发展进一步扩展了这些能力，不仅能够检测小麦样品中的镰刀菌物种，还能进行生物量估算。然而，这些检测方法继承了与其传统PCR前身相同的许多设计局限性。
与此同时，镰刀菌基因组资源的快速扩展和对物种界限认识的提高揭示了广泛的种内和种间多样性。这引发了关于在现代系统发育框架建立之前开发的遗留分子检测方法是否仍然可靠的关键问题。因此，本综述旨在以当代镰刀菌分类学和快速扩展的基因组资源为背景，对用于小麦中镰刀菌物种检测、鉴定和定量的基于PCR的分子方法进行批判性计算机模拟评价。重点在于重新评估在现代系统发育重分类之前开发的遗留引物，评估其针对现有基因组数据的特异性和稳健性。
镰刀菌分子分析面临的挑战
镰刀菌分子分析的挑战源于：（i）产毒途径的多样性，（ii）镰刀菌分类学的不断变化，以及（iii）用于镰刀菌分子分析的方法多样性。
镰刀菌中的真菌毒素：类型、毒理学与法规
在小麦中，FHB不仅是穗部病害，同时也是污染问题，因为多种镰刀菌物种的侵染通常导致收获籽粒中出现复杂的真菌毒素混合物。这些毒素驱动了FHB的大部分经济和监管影响，比单纯产量损失更直接地影响籽粒可用性、贸易以及食品和饲料安全决策。因此，用于小麦镰刀菌的分子检测系统不仅需要评估其分类学分辨率，还要评估其捕获与不同物种和化学型相关的基础真菌毒素风险的能力。
最值得关注的真菌毒素类群是单端孢霉烯族化合物和玉米赤霉烯酮（ZEN），原因在于它们在受感染谷物中的普遍存在及其毒理学效应。单端孢霉烯族化合物是小麦中最重要的一类，分为四种主要结构类型，其中A型和B型最为普遍。A型真菌毒素包括T-2毒素、HT-2毒素和二乙酰藨草镰刀菌烯醇，而B型包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）和雪腐镰刀菌烯醇（NIV）。除单端孢霉烯族化合物外，镰刀菌物种还产生ZEN及其代谢物（α-玉米赤霉烯醇和β-玉米赤霉烯醇），构成一类具有雌激素活性的间苯二酚酸内酯。伏马菌素主要由轮枝镰刀菌和层生镰刀菌产生，串珠镰刀菌素也是重要的镰刀菌毒素，但它们的出现主要局限于玉米。
镰刀菌分离株产生的特定真菌毒素组合称为其化学型，主要由真菌毒素基因簇内生物合成基因的存在和等位基因变异决定。重要的是，同一物种内的不同分离株之间可能存在化学型变异。例如，在禾谷镰刀菌物种复合群内，分离株根据其单端孢霉烯族化合物谱分为不同的化学型：3-ADON、15-ADON、NIV或NX产毒型，每种化学型反映了单端孢霉烯族化合物生物合成基因簇（BGC）中Tri1、Tri7和Tri13等基因的不同等位基因变异。化学型分布在地理区域间差异显著，并受寄主作物差异、环境条件和当地镰刀菌种群的进化历史影响，对真菌毒素风险评估和检测策略具有重要意义。
单端孢霉烯族化合物：结构、出现与生物合成
单端孢霉烯族化合物以保守的四环12,13-环氧单端孢霉-9-烯（EPT）核心结构为特征，C-12,13环氧基对其生物活性和毒性至关重要。A型单端孢霉烯族化合物在C-8位缺乏羰基，而B型在该位置具有羰基或羟基。在小麦中，单端孢霉烯族化合物主要由禾谷镰刀菌（狭义）、黄色镰刀菌、亚洲镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、兰氏镰刀菌和梨孢镰刀菌产生。历史上，T-2和HT-2等A型单端孢霉烯族化合物在小麦中的检出率低于DON和ZEN。然而，欧洲监测数据分析显示，自2010年前后，受污染小麦中T-2和HT-2的相对比例有所上升，表明镰刀菌种群发生了转变。在B型单端孢霉烯族化合物中，DON是全球最普遍的单端孢霉烯族化合物，常与其乙酰化衍生物3-ADON和15-ADON共存。相比之下，NIV在大多数小麦种植区较少见，这主要反映了区域间镰刀菌物种组成和化学型结构的差异。
除母体化合物外，单端孢霉烯族化合物还以结合态或"隐蔽型"真菌毒素形式存在，通过植物解毒过程形成，毒素可与葡萄糖等极性部分结合。这些隐蔽型形式因其极性增加且缺乏商业可用的标准品而逃避常规分析检测。然而，它们可能对食品安全构成额外威胁，因为在消化过程中可能水解释放出有毒的母体化合物。
单端孢霉烯族化合物通过生物合成途径合成，该途径由约15个基因组成的BGC编码，通常分布在三个染色体位点上。关键基因包括编码单端孢二烯合酶的Tri5，以及多个细胞色素P450单加氧酶如Tri1、Tri4和Tri11，催化连续的加氧步骤。A型和B型单端孢霉烯族化合物的区别主要由Tri1的等位基因变异决定。Tri8和Tri16基因编码乙酰转移酶；这些基因内的变异导致化学型差异，Tri8的替代等位基因产生15-ADON或3-ADON，Tri16功能产生T-2毒素。Tri6和Tri10编码调节单端孢霉烯族化合物BGC中其他基因表达的转录因子，而Tri12编码负责毒素输出的转运蛋白。由于单端孢霉烯族化合物BGC内观察到广泛的遗传多态性，特别是在Tri3、Tri5、Tri7、Tri8、Tri12、Tri13和Tri16等基因中，已开发出众多分子基因分型检测方法用于检测和定量镰刀菌物种的毒素生物合成潜力。
ZEN：结构、出现与生物合成
ZEN是一种非甾体类雌激素性真菌毒素，属于间苯二酚酸内酯类，其特征是具有大环内酯环和酚羟基，能够与雌激素受体结合。由于其雌激素模拟特性，ZEN影响内分泌功能，并与人类和动物的生殖障碍相关。ZEN化学性质稳定、亲脂且耐热，能够在食品加工和储存过程中持续存在。在小麦中，ZEN主要由禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌产生。在欧洲范围内，ZEN仍然是食品和饲料小麦中与DON共存的常见共污染物，这与关键FHB物种如禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌共同产生这些毒素一致。
除游离形式外，ZEN以多种生物学活性形式存在，包括其I相代谢物α-玉米赤霉烯醇和β-玉米赤霉烯醇，其中α-玉米赤霉烯醇的效力显著高于ZEN本身。与单端孢霉烯族化合物类似，在植物代谢和食品加工过程中，ZEN也可转化为ZEN-14-葡萄糖苷等"隐蔽型"衍生物。由于隐蔽型真菌毒素的存在代表了直接生化检测的重要分析盲区，靶向ZEN生物合成基因的分子方法为评估镰刀菌物种的产毒潜力提供了补充策略。在镰刀菌中，ZEN BGC跨度约50kb，包含四个必需基因：两个编码聚酮合酶（PKS13和PKS4）的基因和两个编码调节蛋白的辅助基因（ZEB1、ZEB2）。
监管框架
镰刀菌真菌毒素与明确且特征明确的不良健康效应相关。DON可诱导人类和家畜呕吐和免疫抑制。NIV被认为比DON具有更强的细胞毒性，可损害肠道屏障完整性、免疫功能和造血功能，而T-2和HT-2毒素表现出特别高的急性毒性。ZEN通过模拟雌激素影响激素平衡而充当内分泌干扰物。欧盟目前实施一些最严格的限量标准，未加工小麦中DON最高水平设定为1250 μg/kg，ZEN为100 μg/kg，T-2和HT-2毒素总量为1000 μg/kg。相比之下，国际食品法典委员会（CAC）指南通常限制较少，允许原料谷物中DON含量高达0.2 mg/kg，且未针对各类谷物商品建立统一的ZEN最高限量，目前CAC也未对T-2和HT-2毒素设定最高限量。值得注意的是，尽管NIV比DON具有更强的细胞毒性，但目前尚未建立欧盟和CAC监管最高限量。
镰刀菌分类学和检测方法的演变
镰刀菌属由Link于1809年建立，历史上仅基于形态学变异即包含超过1000个物种。早期分类学家如Wollenweber和Reinking试图将镰刀菌分为16个组和65个物种。相比之下，20世纪40年代Snyder和Hansen提出的"九种"概念将镰刀菌的各种形态归并为仅九个广义物种。20世纪末，随着生物学和系统发育物种概念的出现，分类学细化加速。1970年代至1990年代的配对研究揭示了形态学物种内存在隐存生物学物种。"一种真菌，一个名称"原则的实施以及分子系统发育学的最新进展重塑了镰刀菌分类学，表明镰刀菌属包含超过400个不同物种，组织成23个单系物种复合群，可彼此层级嵌套。例如，禾谷镰刀菌物种复合群（全球FHB的主要病原）嵌套在接骨木镰刀菌物种复合群内。
早期检测方法：形态学和培养学方法
历史上，镰刀菌检测基于病原分离后的形态学特征。然而，这种方法耗时且需要高度专业化的分类学专长。许多官方指南和规程仍包含基于形态学的小麦镰刀菌检测方法。仅基于形态学的检测可能导致次要优势物种（包括兰氏镰刀菌）代表性不足或完全掩盖，使多样性评估复杂化。其他方法如基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）已被探索作为真菌鉴定的快速方法。虽然MALDI-TOF能够实现镰刀菌属水平的快速鉴定，但其在物种复合群内的区分能力仍然有限。
ITS条形码和多位点测序
核糖体DNA的ITS区域测序被Schoch等人（2012）提议为通用真菌条形码，原因是该区域具有较高的种间变异性和易于扩增的特点。虽然ITS测序在一般真菌鉴定中仍被广泛使用，但它缺乏在物种水平上区分镰刀菌的分辨率。为弥补这些不足，镰刀菌研究者转向多位点DNA条形码。多位点序列分型（MLST）通过分析五到七个持家基因提供改进的分辨率。在此基础上，系统发育物种识别的谱系一致性（GCPSR）框架成为镰刀菌物种界定的现行金标准，利用超过10个不连锁位点通过谱系一致性解析隐存物种。O'Donnell等人（2015）建议了一个用于镰刀菌属分析的多基因扩增子测序panel，包括TEF1（翻译延伸因子1-α）、RPB1和RPB2基因的蛋白编码区域。为支持这一点，Fusarium-ID数据库作为相关镰刀菌基因序列和参考菌株数据的策展存储库而开发。
功能检测和霉菌毒素生物合成基因
随着基因组数据的扩展，研究重点从分类学鉴定转向功能检测，特别是靶向真菌毒素BGC以预测产毒潜力。早期例子包括靶向单端孢霉烯族化合物生物合成基因（如Tri5、Tri6和Tri13）的PCR检测方法，以推断产毒潜力和化学型，而非物种身份。这种功能方法允许在不需完全物种分辨的情况下快速筛查小麦和谷物样品的真菌毒素风险，并仍在监测和风险评估计划中广泛应用。
基于PCR的镰刀菌分子检测的进展
除常规终点PCR外，定量、数字和多重PCR的发展扩展了镰刀菌检测的灵敏度、定量能力和可评估靶标数量。定量和数字PCR支持真菌DNA的估算或绝对定量，而多重检测允许同时检测小麦中的多种镰刀菌物种。
镰刀菌基因组资源
与基于PCR的分子检测进展并行，镰刀菌基因组资源在过去二十年中也得到改善。第一个禾谷镰刀菌PH-1参考基因组是最早利用早期短读长测序技术进行基因组测序和组装的丝状真菌基因组之一。此后，镰刀菌基因组的可用性以前所未有的速度扩展，达到数千个基因组。早期工作集中在少数最重要的镰刀菌物种上。过去十年中，多个物种的多个分离株被测序，揭示了物种复合群内的广泛变异，包括亚端粒多样性和物种复合群内谱系特异性（附属）染色体的存在。
方法
识别已发表的基于PCR的检测方法
按照PRISMA指南进行了系统文献综述（SLR）检索，以识别小麦中镰刀菌分子（基于PCR）检测的研究。使用定制布尔检索字符串查询Scopus和Web of Science两个主要数据库，结合与镰刀菌、小麦、PCR引物和检测方法相关的关键术语，年份不受限制。去除重复后，剩余147项独特研究进行筛选。纳入标准为使用基于PCR技术研究小麦中镰刀菌物种或评估用于镰刀菌检测或定量的引物组。排除标准包括关注非镰刀菌病原体、非小麦病原体或非PCR方法的研究。
基因组选择
从NCBI GenBank数据库检索了一套包含16种与小麦感染相关的镰刀菌物种的31个基因组组装。起始点是Alisaac和Mahlein（2023）编制的物种列表。部分物种因无公开可用的基因组组装而无法纳入。相反，亚洲镰刀菌、兰氏镰刀菌和假禾谷镰刀菌被添加到基因组列表中。对于某些选定物种，有多个基因组组装可用。基因组完整性使用BUSCO v5.7.1针对sordariomycetes_odb10谱系数据集评估。此外，使用QUAST v5.2.0评估组装连续性和序列质量指标。根据质量将基因组列表分为两个层级：核心panel由满足以下三个标准的高质量组装组成：（i）注释的染色体水平组装，（ii）N50值超过3 Mb，（iii）测序菌株的生物学元数据完整性；扩展panel由质量较低、注释有限或代表机会性/次要病原体的组装组成。
所选基因组内BGC检测
为评估所选镰刀菌基因组panel中TRI和ZEN BGC的分布和完整性，使用一组经典参考序列作为查询进行了全基因组BLASTn分析。共从多个来源汇编了代表28个独特生物合成位点的参考种子序列，包括24个TRI基因和4个ZEN基因。BLAST搜索以≥50%序列同一性、≥50%查询覆盖度和E值≤1×10
?20为阈值。保留的位点使用基于加权百分比同一性和覆盖度的5级评分系统进行评估。基因按生物合成功能组织：核心簇基因、必要外部基因、途径决定因子和化学型特异性标记。基因组按化学型分类排序，以揭示生物合成途径关系。
已发表引物的计算机模拟评价
从文献检索中识别的论文中提取引物序列。使用自定义Python脚本对引物特异性进行全基因组计算机模拟分析。该脚本执行三个关键步骤：（1）在所有输入基因组中识别引物结合位点，错配容忍度为0–5个错配/引物；（2）评估所有可能的引物方向（包括反向互补）；（3）检测推定扩增子大小，仅保留与来源出版物中报道长度±20%一致的扩增子。此外，根据引物内位置记录错配碱基，特别关注引物3'端末三个碱基内发生的错配。
为评估所选镰刀菌基因组集合之外潜在的脱靶扩增，每个引物对提交至NCBI Primer-BLAST工具，针对整个核苷酸（nt）数据库进行比对。BLAST配置包括三个相关分类组——镰刀菌属（taxid:5506）、更广泛的真菌界（taxid:4751）和小麦（taxid:4565）——以识别预期靶标之外可能的假阳性结合事件。
引物性能评分采用统一评分框架，评估针对所选镰刀菌基因组集合的计算机模拟检查（I-score）和Primer-BLAST排他性（B-score）。每个组分按相同的0–2标度评分。最终引物分数计算为I-score和B-score之和，并使用字母A–E编码，其中A为最高分，E为最低分。
FusaMIQE框架的开发
遵循2025年开发的新MIQE 2.0检查表以促进定量实时PCR试验的良好实践，通过适应该综述背景的要求，同时考虑分类学和化学型表征，提出了FusaMIQE框架。
基于PCR的镰刀菌分子分析检测方法评估
策展镰刀菌基因组panel
策展基因组panel由代表与小麦FHB相关的16种镰刀菌物种的31个组装组成（见表1）。虽然这些物种中的大多数是有记录的FHB病原体，但测序菌株来源于包括小麦、玉米、燕麦、大麦等多种寄主。组装分为核心panel（n=16）和扩展panel（n=15）。BUSCO分析表明所有组装的基因组完整性均较高，完整单拷贝直系同源物范围为98.6%至99.6%。组装连续性各异：N50值从0.49 Mb（黄色镰孢）到9.99 Mb（尖孢镰刀菌）不等。23个所选基因组在染色体水平上完整，8个为contig和scaffold水平组装。9个物种有多个菌株可用。只有15个基因组来自可追溯的菌种保藏中心。同样，只有15个基因组具有已知的已报道化学型。
BGC分析
全基因组BLASTn分析在所有选定的镰刀菌基因组中鉴定了TRI和ZEN BGC。然而，基因组成和置信度与先前实验确定的化学型分类密切相关。A型TRI产毒物种（拟枝孢镰刀菌和兰氏镰刀菌）在早期途径和调节TRI基因（Tri5、Tri4、Tri6、Tri10、Tri11、Tri12）中显示出一致的高置信度检测。然而，常用于B型单端孢霉烯族化合物诊断的几个基因表现出降低的置信度或缺失。已知的DON产毒物种（包括3-ADON和15-ADON化学型）表现出高度一致且近乎完整的TRI基因谱。NIV产毒物种表现出更多样的TRI基因检测模式。被分类为非产毒型（NP）的基因组缺乏对大多数核心单端孢霉烯族化合物生物合成基因的高置信度检测。
属级分辨率的镰刀菌检测引物
两项研究报告了旨在用于镰刀菌属水平筛选的引物组，靶向β-微管蛋白和TEF1-α位点。在这些检测方法中，特异性评估表明对镰刀菌的排他性有限。βt1/βt2引物扩增296-bp β-微管蛋白片段，但Primer-BLAST显示低特异性（98个非靶标分类群）。巢式TEF1-α检测方法在两者中表现最佳，Primer-BLAST中仅返回一个非靶标命中（Bionectriaceae sp.）。
物种级分辨率的镰刀菌检测引物
识别了19项报道用于实现小麦中镰刀菌物种检测物种级分辨率引物组的研究。这些检测方法跨越二十多年，通过多种策略开发，包括随机多态性片段发现、核糖体操纵子靶向、单拷贝持家基因等。评估了53对引物对，6对达到A级，8对B级，14对C级，14对D级，11对E级。引物性能在开发时间方面未显示出明显的时间趋势。例如，最早的RAPD衍生检测方法之一Fc01F/Fc01R仍达到高特异性（A级），而几种更近期的靶向EF1α或tRNA-Ile位点的引物显示出潜在的实质性交叉反应。
虽然错配位置未在评分框架中明确加权，但额外注释并报告了引物3'端末三个碱基内发生的引物-模板错配。性能较强的引物对，特别是被分配A和B级的引物对，总结于表4。
RAPD衍生检测方法
RAPD引物是最早开发的引物之一。Schilling（1996）开发了三对基于RAPD的引物组，其中仅有OPT18F/OPT18R表现出对黄色镰刀菌可靠的物种级特异性（B级）。该引物对随后被Klemsdal和Elen（2006）在一管巢式PCR检测中进一步优化，内部引物对（FculBF/FculBR）表现出更高的物种特异性并获A级。Parry和Nicholson（1996）为梨孢镰刀菌报道了一种RAPD衍生引物对（Fp82F/Fp82R），获C级。P. Nicholson等人（1998）识别了特异性针对禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌的多态性RAPD位点。Fc01F/Fc01R引物对表现出对黄色镰刀菌的高特异性。Waalwijk等人（2004）将Fg16F/Fg16R、Fc01F/Fc01R和Fp82F/Fp82R检测方法重新设计为实时qPCR，靶向原始扩增子衍生的短内部片段。计算机模拟评估表明F. graminearum引物仍存在脱靶检测F. asiaticum和F. meridionale的可能性。
靶向核糖体操纵子
Mishra等人（2003）开发了快速多重PCR无凝胶诊断工具，靶向核糖体DNA ITS区域的序列变异性。计算机模拟评估和Primer-BLAST显示与多种镰刀菌物种和非镰刀菌分类群存在实质性交叉反应。Kulik等人（2004）开发了靶向ITS2 rDNA区域的物种特异性PCR检测方法用于检测拟枝孢镰刀菌，也表现出潜在的交叉反应问题。高度可变的基因间隔区（IGS）也被用于开发镰刀菌物种特异性引物。Jurado等人（2005）报道了五对用于检测特定镰刀菌物种的引物对。
单拷贝持家基因
Aoki和O'Donnell（1999）报道了一种靶向TEF-1α区域的引物对用于检测假禾谷镰刀菌。Nicolaisen等人（2009）设计了11对靶向EF1α基因的物种特异性引物对，但计算机模拟分析显示仅F. poae特异性引物（FpoaeA51/FpoaeA98）表现出一致的物种特异性。Sanoubar等人（2015）报道了靶向β-微管蛋白基因的禾谷镰刀菌特异性引物Fgtubf/Fgtubr，分析表明该检测方法与35种镰刀菌物种存在广泛交叉反应。
其他用于镰刀菌物种检测的基因
L. Niessen等人基于Tri5基因序列比对开发了一系列物种特异性引物组。其中梨孢镰刀菌（Tox5-1/Tox5-poae_R）和拟枝孢镰刀菌（Tox5-1/Tox5-sporo_R2）引物对表现出物种特异性扩增。磷酸盐通透酶基因被Stakheev等人用于开发检测黄色镰孢的引物对。CYP51C基因也用于镰刀菌物种解析。
靶向tRNA-Ile基因的多重检测
Deng等人（2024）开发了一种用于检测禾谷镰刀菌、假禾谷镰刀菌、层生镰刀菌和轮枝镰刀菌的多重PCR检测方法。计算机模拟分析显示对假禾谷镰刀菌具有高特异性，而其他引物显示出与镰刀菌属内其他物种的交叉反应。
单端孢霉烯族化合物（TRI）簇检测方法
TRI基因Tri5、Tri4、Tri6和Tri10-12是TRI BGC的核心组分，经常用作TRI产毒镰刀菌物种的分子标记。针对核心TRI基因的检测方法可作为TRI生物合成能力的代理。Tri3、Tri12、Tri7和Tri13等化学型相关TRI基因的多态性被靶向以区分3-ADON、15-ADON和NIV化学型。基于Tri3和Tri12的检测系统表现出极高的特异性。基于Tri13的检测方法对预期目的表现稳健，而基于Tri7的确认步骤仅对DON具有特异性。
ZEN BGC检测方法
PKS4基因是ZEN产毒镰刀菌物种最广泛采用的标记。Neera和Murali（2021）报道的Pks4-F/pks4-R引物组在所有ZEN产毒基因组中一致地产生预期743-bp扩增子。
qPCR用于镰刀菌检测和定量
qPCR能够灵敏地检测和定量小麦中的镰刀菌DNA。MIQE指南为qPCR实验的报告建立了标准。基于MIQE和MIQE 2.0建立了一个镰刀菌定制的检查表FusaMIQE，将原始九个MIQE类别整合为六个核心领域：研究设计；样品和核酸质量；引物和靶标信息；qPCR规程；数据分析；报告和可重复性。
讨论
基因组选择和数据集局限性。计算机模拟引物评估的可靠性受基因组选择、组装质量和元数据完整性的强烈影响。不同组装之间的连续性差异反映了测序策略。片段化组装和基因组不完整表示可能掩盖潜在的脱靶结合位点，导致引物特异性被高估。元数据完整性差异显著，应用所有三个核心标准会将数据集减少到不到10个基因组。
BGC完整性分析。TRI和ZEN BGC的全基因组分析显示了BGC结构与实验定义的化学型分类之间的强相关性。B型TRI产毒菌表现出基本完整且一致的TRI基因谱，而其他化学型之间观察到较高变异性。Tri9位点显示了有限的参考序列多样性的影响。
属级检测和通用引物。属级检测在许多应用场景中仍然重要。两种小麦相关镰刀菌属特异性引物组均表现出与镰刀菌属外分类群的交叉反应。
物种级分辨率的引物。可靠的物种级分辨率面临固有挑战，特别是在最近分化的物种复合群内。RAPD衍生标记的性能差异反映了设计局限性和分类学重分类的影响。核糖体操纵子区域引物在镰刀菌物种级分辨率中表现不佳。单拷贝持家基因表现参差不齐。在组合评估框架下，没有已发表的靶向禾谷镰刀菌的引物达到最高引物分数。
基于BGC的检测。计算机模拟分析依赖于菌株元数据，因此"化学型"指基因组注释而非实验确认的表型。靶向核心基因如Tri5的遗留检测方法常被用作TRI产毒潜力的通用代理，但Tri5可能在非产毒基因组中以假基因形式存在。
qPCR用于镰刀菌检测和定量。定量可靠性受提取效率、PCR抑制和真菌DNA与毒素产生之间生物学脱节的影响。报告分析表明许多已发表的镰刀菌qPCR检测方法可以改进元数据共享。
检测验证和报告的良好实践。使用特征明确的参考材料进行初步验证至关重要。引物选择只是检测质量的一个组成部分，完整的工作流程应包含详细的方法描述和透明的报告。
基于扩增子的高通量测序方法。高通量扩增子测序扩展了镰刀菌监测能力，能够并行检测多种镰刀菌物种。
建议
基于本综述中PCR和qPCR诊断方法的再评估，可提出以下实际建议。利用现代基因组资源可以系统性地重新评估早期PCR标记。高质量、注释完善且具有分类代表性的基因组组装对于改进诊断检测设计至关重要。全基因组测序（WGS）是最全面的方法；在WGS不可行的情况下，扩增子测序提供了有价值的中间解决方案。靶向直接参与毒素生物合成的因果基因的诊断检测方法应优先于代理标记。没有单一基因能提供跨越所有镰刀菌谱系的普遍物种级分辨率，标记选择应依赖上下文。新兴方法包括多重和数字PCR平台。
结论
本综述通过现代基因组资源的视角系统性地重新评估了基于PCR和qPCR的小麦产毒性镰刀菌物种检测和定量分子方法。通过将现有引物与策展基因组panel进行基准比较，证明许多广泛使用的检测方法受到分类学复杂性和历史设计假设的制约。必须明确区分分类学检测、化学型推断和定量估计，以避免过度解读分子信号。
