综述：研究氧化还原调控结构转变的新兴实验与计算方法

《FEBS Letters》：Emerging experimental and computational methods for studying redox-regulated structural transitions

　　

基于硫醇的氧化还原开关利用半胱氨酸和硒代半胱氨酸的独特亲核性，将实时细胞氧化还原波动动态耦合至代谢调控和信号通路。解析驱动这些氧化修饰的精确原子级热力学与动力学机制，长期受限于瞬时中间体的化学不稳定性和经典分子动力学模拟的巨大计算成本。然而，化学选择性小分子探针的最新进展现已能够高纯度捕获和富集特定的次磺酸和亚磺酸状态。与此同时，向机器学习（ML）、图神经网络（GNNs）和蛋白质语言模型的范式转变绕过了传统的计算瓶颈，使得在数秒内实现对氧化还原开关的高通量、蛋白质组范围预测。此外，新兴数据表明，这些氧化修饰不仅改变结构有序的蛋白质，还主动调控内在无序蛋白质（IDPs）和生物分子凝聚体中的条件性折叠转变与结构转化。在此，研究人员对这两类实验与计算进展进行了比较性综述，并强调生成扩散模型的整合如何能够促进氧化还原蛋白质组中条件性、多态结构集合的实时模拟。

ROS in biological systems: 活性氧（ROS）包括超氧阴离子、羟基自由基、过氧自由基等自由基以及过氧化氢（H₂O₂）、次氯酸等非自由基，在细胞稳态、防御和适应中发挥核心作用。半胱氨酸（Cys）的高亲核性和多氧化态使其成为氧化还原敏感的关键残基。硫醇（–SH）经氧化翻译后修饰（OxiPTMs）形成可逆的S-亚磺酰化（–SOH）、S-谷胱甘肽化（–SSG）、二硫键（–SSR）等，或不可逆的S-亚磺化（–SO₂H）和S-磺化（–SO₃H）。硒代半胱氨酸（Sec）是硒类似物，具有更低pKa和氧化还原电位，其硒醇（–SeH）氧化形成硒代次磺酸、硒代亚磺酸等，且Sec参与谷胱甘肽还原酶（GR）和硫氧还蛋白还原酶（TrxR）等关键酶。

Thiol-based redox switches in cellular regulation: 硫基氧化还原开关通过可逆氧化半胱氨酸残基将氧化应激感知与信号和代谢调控偶联。KEAP1–NRF2通路中，KEAP1的多个低pKa半胱氨酸（如Cys151、Cys273）氧化导致构象重排，抑制NRF2泛素化并激活抗氧化反应元件（ARE）转录程序。Hsp33在还原条件下结合Zn²⁺失活，氧化后释放锌并形成二硫键，触发部分去折叠暴露疏水表面，获得分子伴侣功能。酵母Get3在氧化应激下发生寡聚化，从尾部锚定蛋白靶向因子转化为ATP非依赖性持家伴侣。2-Cys过氧化物氧还蛋白过度氧化为亚磺酸后组装成高分子量寡聚体，发挥伴侣活性。

Quantification of intracellular changes in cells using in vivo redox sensors: 基因编码的氧化还原传感器基于荧光蛋白（如GFP、mCherry）衍生物，将氧化还原敏感半胱氨酸插入其中。氧化导致传感器荧光激发或发射性质改变，以比例方式定量细胞内氧化还原动态。Grx1-roGFP报告谷胱甘肽氧化还原电位，Orp1-roGFP选择性监测H₂O₂依赖的氧化通路；红色荧光和细胞器靶向传感器扩展了区室化监测能力。

Experimental redox proteomics tools: 化学小分子探针靶向游离半胱氨酸硫醇。碘乙酰胺（IAM）和N-乙基马来酰亚胺（NEM）存在选择性和稳定性问题，甲基磺酰苯并噻唑（MSBT）选择性更高。基于同位素标记的定量方法，如ICAT、OxICAT和IodoTMT，通过轻重标签区分还原和氧化状态并结合富集步骤。点击化学（CuAAC）可将炔基探针（IPM）与生物素连接以实现富集。对于次磺酸（–SOH），1,3-二酮探针如dimedone衍生物（DAz-1/DAz-2）通过亲核加成共价捕获；对于亚磺酸（–SO₂H），利用亲电氮物种（ENS）如C-亚硝基苯甲酸酯（NO-Bio）进行标记。

Predictions of redox switches: 计算生物物理学通过量子力学（QM）、分子力学（MM）和机器学习（ML）补充实验，计算标准氧化还原电位并解析氧化还原开关的结构机制。挑战在于硫和硒的多样氧化态、局部微环境对半胱氨酸反应性的精细调控，以及蛋白质基质和溶剂化层的动态复杂性。

Predicting cysteine reactivity: 半胱氨酸pKa是决定其反应性的核心参数。传统方法如求解泊松-玻尔兹曼方程或恒定pH分子动力学（CpHMD）计算昂贵。基于图神经网络（GNNs）的GSnet和aLCnet通过三维结构嵌入和局部原子电荷（10 ?半径内）实现高精度pKa预测，速度远快于传统方法，支持蛋白质组规模注释。

Free-energy calculations of disulfide bonds and Cys-OxiPTMs: 二硫键氧化还原电位通过Crooks高斯交集（CGI）方法结合分子动力学模拟计算，使用混合半胱氨酸/胱氨酸力场和单拓扑变换，预测硫氧还蛋白家族蛋白的氧化还原电位误差约40 mV。对于瞬时OxiPTMs，需采用混合QM/MM方法解析反应机制；反应力场ReaxFF通过键序依赖势能模拟键断裂与形成，可在显式溶剂环境中研究瞬态氧化修饰。

Protein dynamics, disorder, and redox switches: 过氧化物氧还蛋白的催化循环涉及完全折叠与局部去折叠之间的构象转变，决定其对超氧化的敏感性和分子伴侣功能的开关。此外，内在无序蛋白（IDPs）通过液-液相分离（LLPS）形成生物分子凝聚体，其内部碱性微环境降低酪氨酸氧化电位，引发自发自氧化产生活性氧，并形成二酪氨酸交联影响凝聚体老化。算法IUPred2A预测氧化还原敏感的条件性无序区域，大规模分析表明此类区域富集于转录因子、分子伴侣等关键功能类群。

Machine learning and proteome-wide redox predictions: 计算方法涵盖物理模拟与机器学习。深度学习方法如DeepKa和基于蛋白质语言模型（pKALM）可快速预测残基pKa；结构描述符结合极端梯度提升（如FeS-RedPred）可预测金属蛋白氧化还原电位。这些模型在基准数据集上表现良好，但实验验证仍至关重要。

Current limitations and benchmarking challenges in AI-based redox prediction: 当前AI预测器面临数据集有限且异质、静态结构表示忽略动态环境依赖性、基准测试不统一、机制可解释性差等挑战。未来需标准化数据集、改进测试基准并融合实验验证。

Emerging frontiers: generative diffusion models for conformational ensembles of redox switches: 扩散模型（如RFdiffusion、AlphaFold3）通过逆转噪声过程学习蛋白质结构分布。未来可条件化输入半胱氨酸化学状态（如还原硫醇或氧化亚磺酸），快速生成氧化还原开关的“开/关”构象集合，并适用于IDPs和凝聚体的多构象建模，从而绕过传统分子动力学模拟的计算瓶颈。