综述：抗体工程化肽——治疗创新的机会与策略

《FEBS Letters》：Engineering peptides into antibodies—opportunities and strategies for therapeutic innovation

　　

治疗性肽和单克隆抗体（mAbs）已彻底改变了现代医学，在肿瘤学、代谢性疾病、自身免疫和感染性疾病领域实现了强效且高选择性的治疗。至今，已有超过200种mAbs和约100种肽类药物获得监管批准，合计产生数千亿美元的年度全球销售额——随着这两类候选药物中超过一千种额外候选药物进入临床试验，这些数字还将进一步增长。尽管取得了这些并行成功，肽和抗体在药物开发中占据着不同的生态位，每种都因其特有的优势与内在缺陷组合而塑造。

肽是由肽键连接的氨基酸短链，通常长度少于40–50个残基，质量低于4–5 kDa。它们既可通过重组表达也可通过固相化学合成生产。无论分离自天然来源，还是通过文库筛选、计算方法或合理设计发现，肽都能提供出色的靶标选择性和效力，通常针对小分子和抗体均难以攻克的挑战性靶标，如蛋白质-蛋白质相互作用界面、变构口袋和构象动态表面。其小尺寸使其能够进入较大生物制品无法触及的结合位点，其模块化化学特性易于容纳非天然氨基酸、环化和订书肽修饰以施加构象约束并增强功能表现。一些肽甚至在口服给药后表现出生物利用度和细胞膜渗透性以到达细胞内靶标。这些优势伴随着有据可查的缺陷。快速肾脏清除和蛋白水解降解导致循环半衰期短，而较差的水溶性及聚集倾向可进一步使开发复杂化。肽通常也缺乏抗体治疗药物固有的效应功能、多价性和可调的药代动力学特性。

相比之下，主导生物治疗领域的全长免疫球蛋白G（IgG）抗体是由约1300个氨基酸和约150 kDa分子质量组成的大型糖蛋白。治疗性IgG将高特异性和亲和力与长血清半衰期及定制化的免疫系统参与相结合。这些特性源于典型的IgG结构：两条轻链（LCs）与两条重链（HCs）配对，组装成Y形多结构域蛋白。HC差异定义了四种人IgG亚类，其中IgG1、IgG2和IgG4用于治疗。该分子可进一步解析为两个Fab片段和一个Fc片段。每个Fab包含一条LC（由V_L和C_L结构域组成）以及HC的V_H和C_H1结构域，而Fc由配对的C_H2和C_H3结构域组成并携带保守的N-聚糖。抗原特异性和亲和力由互补决定区（CDRs）决定，这些是V_H和V_L结构域中的环，而Fc通过新生儿Fc受体（FcRn）依赖的再循环介导长血清半衰期。Fc还可驱动免疫效应功能，包括抗体依赖性细胞毒性（ADCC）、抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）和补体依赖性细胞毒性（CDC）。

高效IgG结构也施加了重要约束。抗原结合位点（即互补位）主要由CDRs的组成和几何形状决定，这倾向于识别相对平坦或凸起的蛋白质表面，而不利于深而凹的腔穴。IgG的大尺寸进一步将其限制在细胞外靶标，实现组成型而非条件性的靶标结合，并限制组织穿透。除大尺寸外，胃肠道的物理和蛋白水解不稳定性限制了抗体的口服生物利用度。

这些独特而互补的特征推动了越来越多的研究，将肽直接工程化到抗体或抗体片段中，产生旨在结合两个亲本类别最有利特征的杂交分子。此类杂交抗体-肽构建体已被用于安装新颖或正交特异性以进行多特异性靶向、实现条件性激活、将效应功能招募到肽定义的靶标、将载荷递送至特定组织，以及赋予原本短命的生物活性肽以抗体样的药代动力学特性。

为实现这些理想的治疗特性，抗体-肽工程现在涵盖了多种分子形式，包括全长IgG、仅Fc支架、Fabs和单链可变片段（scFv），以及最小抗体衍生结构域如VHHs。在这些形式中，肽可通过移植到CDRs或框架环中、融合至HCs或LCs的N-或C-末端，或通过位点特异性化学或酶促生物偶联进行引入。每种方法在结构相容性、肽展示、价态和可制造性方面都有不同的权衡。

在本综述中，我们聚焦于将肽工程化到免疫球蛋白及其片段中。肽和抗体本身的发现与选择方法不在本文范围内，已在其他地方广泛综述。相反，我们审视抗体-肽融合和偶联物所依据的工程原理、分子架构和设计原理，旨在提炼在抗体与肽界面上构建下一代生物制品的通用经验和方向。

论文主体部分总结

**将肽移植到抗体环中**

抗体由共享特征性免疫球蛋白（Ig）折叠的结构域构成——一个由两条反向平行β-折叠组成的希腊钥匙β-三明治结构，β-链通过链间环连接。每个可变结构域（V_H和V_L）携带三个高度可变的环，称为互补决定区（CDRs），它们是抗原识别的主要决定因素。早在20世纪80年代就已证明，V_H和V_L能耐受CDR替换，因此可变抗体结构域本质上适合在这些环内容纳不同的肽序列。

关于将肽移植到抗体CDR中的早期工作集中于“抗体抗原化”概念，即有意将免疫原性寡肽插入抗体的高变环中以引发针对移植表位的免疫应答。第一个将肽移植到CDR环中以赋予新生物活性的例子是将Arg-Gly-Asp（RGD）基序工程化到IgG的CDR-H3中。所得的抗体通过移植的CDR-H3环同时参与RGD结合整合素以及通过抗体Fc区参与NK细胞上的CD16，从而抑制NK细胞介导的K-562细胞溶解。值得注意的是，单独的RGD肽无法重现这种抑制效应，强调了CDR融合所施加构象约束的关键作用。

Kogelberg等人通过将口蹄疫病毒（FMDV）VP1衣壳蛋白中一个含RGD的17残基环移植到MFE-23 scFv的CDR-H3尖端，工程化出针对α_vβ₆整合素的强效scFv。优化后的二聚体scFv-肽融合体（B6-3）可在酵母中生产，并以约196 nm的IC₅₀有效抑制α_vβ₆介导的细胞粘附。Lane及其同事将一个源自转录因子EB（TFEB）的17残基α-螺旋DNA结合片段移植到Fab片段的CDR-H3中，所得的嵌合Fab获得了亲本抗体所不具备的DNA结合活性。将来自淀粉样蛋白形成蛋白的序列移植到CDR-H3也已得到探索，例如将朊蛋白（PrP）区域移植到b12 IgG1抗体的CDR-H3中，成功结合疾病相关的PrP异构体。

Frederickson等人通过将结合血小板生成素c-Mpl受体（c-Mpl-R）的14残基肽AF12505移植到抗体CDR环上设计血小板生成素模拟物。研究表明，同时移植到CDR-H3和CDR-L2中提供了最高效力，这可能是通过定位两个肽拷贝以同二聚体方式接合受体。Simon等人分析了1330个人κ轻链序列和19个可变区晶体结构，以鉴定LC CDR中可有可无的残基。通过将生长抑素-14移植到CDR-L1和CDR-L2的不同位置，他们证明了成功表达关键取决于保留参与疏水核心接触和框架相互作用的残基。

Sormanni等人提出了一种计算机辅助策略，首先在蛋白质数据银行（PDB）中搜索能与靶标表位以β-链氢键几何配对的“互补肽”，然后将选定的互补肽直接移植到稳定的人单结构域V_H支架的CDR-H3环中。将互补肽同时纳入CDR-H3和工程化CDR-H2的双环变体将亲和力提高了两到三个数量级（K_d约45 nm），尽管以降低支架稳定性为代价。

除了短肽，富含二硫键的折叠刚性肽也可移植到CDR环上以生成新的靶标结合表面。牛的天然抗体中约有10%含有超长CDR-H3（最长约70个氨基酸），折叠成独特的柄-球结构。该球是一个自主的富含二硫键结构域，在亲和力成熟过程中多样化以结合不同抗原。Klewinghaus等人利用抗原特异性球结构域设计了共同轻链双特异性抗体，使用链交换工程化结构域（SEED）技术异二聚化携带不同球的HCs，其中一个球靶向EGFR，另一个靶向NKp30，所得IgG样双特异性抗体引发了有效的NK细胞介导的EGFR过表达肿瘤细胞裂解。Yanakieva等人通过将源自牛的靶向NKp30和EGFR的球互补位移植到人IgG1 C_H3结构域的AB或EF环中，生成对称的双特异性分子。同样的方法被应用于靶向TNF-α的球肽，移植到阿达木单抗的C_H3区域产生了增强TNF-α抑制作用的双特异性构建体。

**肽基因融合至抗体可变域和全长抗体的N-和C-末端**

融合至全长抗体或其分离可变结构域的N-或C-末端可引入额外结合特异性或增加结合亲和力。其他引人注目的应用包括条件性抗体激活、靶向调节生物分布和促进细胞内渗透。Labriola等人通过噬菌体展示分离了以低纳摩尔亲和力结合SARS-CoV-2刺突蛋白胞外域的16聚体肽，通过(Gly₄Ser)₄连接子融合至IgG抗体的LC或HC的N-末端，所得肽-IgG融合蛋白表现出改善的刺突蛋白结合和更高的假病毒中和效力。

Zybody平台将模块化识别结构域（MRDs）基因融合至单克隆抗体的HC和LC的N-或C-末端，使亲本IgG能获得多达四个额外的MRD特异性。一项关键概念验证是工程化的五特异性抗体能同时识别HER2、EGFR、IGF-1R、Ang2和整合素α_vβ₃。zamubafusp alfa (AT-02)是一种将多碱性肽p5R融合至人源化IgG1抗体轻链C末端的抗体-肽融合体，通过双重结合淀粉样纤维和硫酸乙酰肝素赋予泛淀粉样反应性，目前正在系统性淀粉样变性患者中进行II期临床试验。

关于条件性激活抗体，Erster等人将结合VCAM-1的14聚体肽通过含10残基胶原酶可切割基序的连接子融合至抗体HC的N-末端，蛋白水解切割后活性增加约200倍。Probody平台将掩蔽肽通过蛋白酶可切割连接子融合至抗体LC的N-末端，组织特异性蛋白酶切割连接子释放掩蔽肽恢复抗原结合。基于西妥昔单抗支架设计的probody在体内外均表现出条件性蛋白酶依赖性激活，并相比西妥昔单抗在非人灵长类中显示降低的毒性。抗PD-L1 probody pacmilimab (CX-072)已进入人体临床试验。Probody技术也被用于设计probody-药物偶联物（PDCs），如CX-2029（抗CD71 PDC携带MMAE载荷）。此外，肽融合也被用于延长肽的半衰期，例如将Ex-4和瘦素融合至曲妥珠单抗支架的不同位置，产生双功能蛋白，在啮齿动物中大幅延长循环半衰期。

**Fc-肽融合蛋白**

将生物活性肽基因融合至Fc结构域是利用免疫球蛋白内在优势（特别是长血清半衰期和良好稳定性）来克服许多治疗肽快速清除和稳定性限制的有吸引力的策略。Fc-肽融合通常通过将肽连接至人IgG-Fc的N-或C-末端实现，产生大于约50–60 kDa的同二聚体，从而高于肾滤过截留值，大幅减少肾小球清除。Fc部分的主要优势是其pH依赖性结合FcRn，将含Fc蛋白从溶酶体降解中拯救并再循环回血液循环。

罗米司亭（Nplate?）是已批准的肽体，包含一个以高亲和力结合血小板生成素受体的14氨基酸肽，两个拷贝的生物活性14聚体肽通过(Gly)₈连接子分开，并通过(Gly)₅连接子融合至IgG1-Fc的C-末端。Blisibimod (AMG 623)是选择性B细胞激活因子（BAFF）抑制剂，包含两个同源BAFF结合肽通过富含Gly/Ser的连接子融合至IgG1-Fc的N-末端。Trebananib (AMG 386)是中和血管生成素-1和-2的抗血管生成肽体。AMG 819通过20氨基酸肽中和神经生长因子（NGF），在I期临床试验中显示出显著免疫原性，37%的受试者产生抗药抗体（ADAs）。CNTO 528是模拟促红细胞生成素（EPO）生物活性的mimetibody，将20氨基酸生物活性肽融合至IgG1-Fc支架。杜拉鲁肽是一种同二聚体融合蛋白，每条链包含修饰的GLP-1类似物通过Gly/Ser富集连接子基因融合至人IgG4-Fc的N-末端，支持每周一次给药。Efsubaglutide alfa采用IgG2-Fc支架，GLP-1类似物直接融合至IgG2-Fc铰链区N-末端。

Fc-肽融合在癌症治疗中也得到探索，例如将结合癌细胞的短肽融合至IgG1-Fc的N-末端，这些Fc-肽融合体保留靶标结合、激活NK细胞并介导针对多种癌细胞系的ADCC。其他应用包括将结合髓源性抑制细胞（MDSCs）的12聚体肽融合至鼠IgG2b的Fc区域生成肽体以耗竭MDSCs，以及将tertiapinQ肽毒素融合至人IgG1-Fc的C-末端阻断乙酰胆碱激活的内向整流钾电流（IK_ACh）。Fc-肽融合还可用于抗菌药物，例如将抗菌肽融合至IgG1-Fc的N-末端，前有信号肽和组织蛋白酶前结构域以掩蔽抗菌活性直至感染位点蛋白水解切割。

**抗体-肽偶联物和生物偶联策略**

抗体-肽偶联物（APCs）是一类多功能靶向治疗剂，抗体组分提供高结合特异性，肽载荷赋予包括抗菌、细胞毒性或免疫调节活性在内的多种生物功能。与基因融合策略相比，生物偶联在偶联位点选择和载荷多样性方面提供更大灵活性。传统偶联策略主要依赖天然氨基酸残基的非特异性修饰，特别是赖氨酸和半胱氨酸的反应性侧链。N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯激活探针靶向赖氨酸的ε-氨基，而基于半胱氨酸的马来酰亚胺化学由于更高的化学选择性被更广泛采用。

非特异性偶联方法通常产生具有可变偶联位点和载荷分布的异质混合物，这促使该领域转向位点特异性策略。四种主要的位点特异性策略包括：第一，工程化半胱氨酸方法（如THIOMAB技术），通过定点诱变引入半胱氨酸残基；第二，酶促偶联方法，利用微生物转谷氨酰胺酶（mTGase）或分选酶A（Sortase A）的特异性；第三，聚糖重塑策略，利用Asn297处保守的Fc N-聚糖作为位点特异性修饰的柄；第四，遗传密码扩展技术，结合生物正交反应如点击化学，将含非天然氨基酸（如环丙烯赖氨酸衍生物CypK）共翻译整合到抗体中。连接子设计是决定治疗性能的关键因素，可分为不可切割和可切割连接子两大类，后者包括pH敏感、氧化还原敏感和酶响应性连接子。

**翻译挑战**

从功能性构建体过渡到可行药物候选物受制于一系列反复出现的可制造性、稳定性、免疫原性和监管考量。最常见的将肽融合至抗体末端时遇到的问题之一是蛋白水解剪接和附加序列的截短。异质性也是抗体-肽偶联物关注的问题，随机修饰天然赖氨酸或半胱氨酸残基产生宽的PAR分布和异质偶联位点。肽载荷可直接对生产细胞有毒，如天然蜂毒肽消除可回收蛋白表达。引入的肽可扰动宿主抗体支架本身的稳定性，这对环插入的风险最大。免疫原性在所有生物治疗模式中都是关注点，抗体-肽融合体可表现出非常不同的免疫原性，选择非免疫原性肽至关重要。目前尚无专门针对抗体-肽杂交体的监管途径，它们作为生物产品在现有框架下评估，监管负担集中在化学、制造和控制（CMC）包以及构建体的全面免疫原性风险评估上。