综述：核酸作为磷酸钙生物矿化的新兴调节因子

《The FASEB Journal》：Nucleic Acids as Emerging Regulators of Calcium Phosphate Biomineralization

　　

磷酸钙生物矿化是一个高度受调控的过程，是脊椎动物矿化组织形成的基础。尽管蛋白质长期以来被认为是矿物形成的主要调节因子，但越来越多的实验证据表明，核酸也可能通过尚待深入探索的机制参与这一过程。核酸带负电的磷酸骨架、分子结构的多样性以及与磷酸钙相相互作用的能力，使其成为调节矿物成核、生长和相转变的理想候选分子。在本综述中，研究人员首先总结了当前对生理性磷酸钙生物矿化的认识，特别强调胶原蛋白和基质囊泡（matrix vesicles, MVs）在矿物形成中的作用及影响该过程的因素。随后，研究人员探讨了核酸与磷酸钙相互作用的机制，重点介绍核酸吸附、共沉淀和矿物模板化的实验证据。最后，研究人员讨论了支持矿化组织和异位矿化中存在细胞外核酸的日益增多的证据、其多样的生物学来源，以及通过涉及细菌、细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）、细胞死亡和中性粒细胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps, NETs）的机制对病理性矿化的潜在贡献。这些观察结果表明，核酸应被视为磷酸钙生物矿化的潜在贡献者。尽管其精确的生理功能仍知之甚少，但将核酸整合到当前的机制模型中可能完善研究人员对生理性和病理性矿化过程的理解，从而为生物标志物发现和治疗研究开辟新途径。

**1 引言**

生物矿化是后生动物早期进化过程中出现的基本生理过程，尤其在脊椎动物中受到广泛研究。矿化组织的出现是一项重大进化创新，深刻促进了脊椎动物的多样化和进化成功。脊椎动物进化的关键事件之一是铰链式颌的发展，并伴随众多形态和表型创新。骨化鱼类与软骨鱼类约在4.5亿年前分化。有假说认为，后口动物共享一个祖先特化的“生物矿化工具包”，为矿物形成提供了分子基础。在人类中，已鉴定出六种矿化组织：骨、钙化软骨、牙体组织（包括牙本质、釉质、牙骨质）以及耳石。前五者含有磷酸钙（calcium phosphate, CaP）矿物相，耳石则含碳酸钙。生理和理化因素影响矿物形成，多种生物大分子在时空上受更严格生物学控制来引导矿化过程。蛋白质已被广泛研究并被认为是生物矿化的主要调节因子，它们稳定无定形矿物相、控制晶体成核和生长、抑制病理性矿化、促进矿物吸收并协调矿化过程的多个阶段。多糖和脂质也参与生理性矿化，但其作用远不如蛋白质被充分探索。相比之下，核酸在磷酸钙生物矿化领域受到的关注很少。然而，若干理化和生物学观察支持其参与矿物形成的可能性：其带负电的磷酸骨架和结构多样性赋予其与磷酸钙前体相互作用、作为矿物成核模板以及调节相转变的能力。本综述检验了核酸构成磷酸钙生物矿化先前被忽视的调节因子这一假说。

**2 生物矿化机制**

脊椎动物的天然矿化组织是由软生物物质和硬矿物相组成的复合材料，矿物相主要为弱结晶的离子取代羟基磷灰石（hydroxyapatite, HAP）。生物矿化主要发生在细胞外基质（extracellular matrix, ECM）中，特别是在自组装胶原蛋白和其他生物大分子组成的致密网络内。不同类型的胶原蛋白自组装成超分子结构，以满足不同的生理和力学要求。

**2.1 纤维内与纤维外矿化**

胶原蛋白自组装成同源或异源纤维，形成通常被视为CaP生物矿化模板的超分子结构。胶原纤维通过与非胶原蛋白（non-collagenous proteins, NCPs）和钙离子的特异性相互作用，参与矿化的调控过程。纤维内矿化指矿物在纤维内形成，纤维主要由I型胶原组成，具有约67 nm的特征性D周期。矿化过程通常描述为离子和/或无定形矿物前体渗入胶原纤维，随后形成无定形磷酸钙（amorphous calcium phosphate, ACP），ACP再转变为HAP。显微镜研究证实CaP存在于纤维内和纤维间区域。然而，该过程的动力学主要使用无细胞体外模型研究。纤维内矿化机制有助于理解CaP颗粒的成核和生长，以及矿化对骨力学性能的贡献。NCPs（主要是固有无序蛋白，intrinsically disordered proteins, IDPs）在此过程中发挥重要作用。但体外模型未能充分探索纤维外矿化的可能性。在矿化组织中，纤维外空间的矿物比例超过胶原纤维内的矿物，约占骨组织的60%–80%。

**2.2 基质囊泡**

矿化的起始被认为发生在细胞内，通过细胞器（包括内质网（endoplasmic reticulum, ER）和线粒体）之间的协调相互作用进行。ER是钙和磷酸盐积累的主要细胞内位点，随后转移到线粒体，观察到约30 nm直径的CaP颗粒。矿化细胞（如肥大软骨细胞、成骨细胞、成牙本质细胞和“成骨样”血管平滑肌细胞）释放基质囊泡（MVs），这是一种启动矿物形成的特化细胞外囊泡亚型。MVs提供受限的微环境，通过其特定的矿化相关蛋白含量促进CaP成核和生长，包括组织非特异性碱性磷酸酶（tissue nonspecific alkaline phosphatase, TNAP）、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1（ecto-nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1, NPP1）、PHOSPHO1和膜联蛋白（annexins）。透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）分析揭示了小鼠成骨细胞释放的MVs内的磷酸钙结节，随后ECM中形成矿物小板。尽管仍有重要问题待解决，但MVs是CaP成核和早期矿物生长的主要位点。

**2.3 影响CaP生物矿化的因素**

CaP生物矿化受内在因素和外在因素调控。内在因素主要涉及钙和正磷酸根离子的浓度，这些离子通过稳态在狭窄范围内严格调节。体内绝大多数钙（>99%）储存在骨骼中，血浆钙浓度为2.2–2.7 mM，游离钙为1.1–1.3 mM。细胞内钙浓度远低于细胞外水平，ER中约100 μM，细胞质中仅0.1 μM。磷酸盐代谢对细胞功能、能量转移、遗传稳定性和骨骼完整性至关重要。体内约80%的磷以CaP矿物形式储存在骨和牙齿中。正常血浆无机磷酸盐（inorganic phosphate, Pi）浓度为0.8–1.5 mM。钙和磷酸根离子的活度受pH、离子强度和温度等理化条件影响。特定分子也可促进或抑制CaP化合物的成核和/或生长。无机焦磷酸盐（inorganic pyrophosphate, PPi）是多种代谢反应的副产物，是CaP矿化的强效抑制剂，其作用受NPP1和TNAP的协同酶活性调控。非胶原蛋白中，小整合素结合配体N端连接糖蛋白（Small Integrin-Binding Ligand, N-linked Glycoprotein, SIBLINGs）家族在矿化调控中起关键作用，包括骨桥蛋白（osteopontin, OPN）、骨涎蛋白（bone sialoprotein, BSP）、基质细胞外磷酸糖蛋白（matrix extracellular phosphoglycoprotein, MEPE）、牙本质基质蛋白1（dentin matrix protein 1, DMP1）和牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein, DSPP）。这些蛋白属于IDPs，具有胶原结合域、HAP结合域和Arg-Gly-Asp整合素结合基序，并经历翻译后磷酸化，可促进或抑制CaP矿化。基质Gla蛋白（matrix Gla protein, MGP）是维生素K依赖性蛋白，通过结合钙离子抑制矿化。因此，研究CaP生物矿化机制需要处理矿物成核、生长和结晶环境的复杂性，涉及酶催化反应、分子相互作用、离子转运等。

**3 核酸与CaP的相互作用**

核酸因其分子结构的多样性、与多种生物实体相互作用的能力以及参与矿化相关机制的潜力，可能在调控矿化过程中发挥关键作用。

**3.1 核酸—CaP共沉淀**

自1973年以来，利用Ca²⁺离子沉淀DNA已用于核酸转染实验。该方法比基于DEAE-葡聚糖的方法具有更高的转染效率和更强的抗DNase能力。预成型单层或多层CaP纳米颗粒作为核酸载体，通过共沉淀过程实现递送。在3D培养系统中，CaP纳米颗粒表现出更好的DNA递送效果。CaP核心在内涵体中溶解，释放siRNA至靶细胞胞质。从机制角度看，核酸与CaP的共沉淀研究很少。X射线衍射（X-ray diffraction, XRD）分析显示DNA未显著改变HAP的晶体结构，但DNA似乎减缓了HAP形成并引起晶格参数的微小变化，表明DNA与生长中的矿物相存在相互作用。DNA折纸实验表明矿物沉积局限于DNA架构并再现其整体形状，突出了DNA模板化CaP矿化的能力。石英晶体微天平测量表明DNA包被表面加速异质CaP矿化并促进HAP样相的形成。这些观察表明DNA可作为矿化的结构模板，CaP沉积再现DNA架构的几何形状，而非遵循优选的晶体学生长方向。

**3.2 核酸–CaP相互作用**

DNA已在古老矿化组织中被检测到，表明骨具有长期保存核酸的能力。骨可被视为半封闭的矿物基质，减缓DNA的水解降解。骨密度和低孔隙度与DNA保存相关。Goldberga等人利用动态核极化（dynamic nuclear polarization, DNP）增强核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR）证明了天然小鼠颅骨中存在细胞外DNA（extracellular DNA, eDNA）。根据计算机模拟研究，核酸与CaP矿物间的相互作用主要是静电性的，涉及HAP表面的钙离子与DNA的磷酸基团。实验研究发现，pH升高（6.8至8.0）导致磷酸基团去质子化，降低DNA与HAP的结合亲和力；高盐浓度通过减少静电相互作用减弱双链DNA与HAP的结合，而单链DNA（single-stranded DNA, ssDNA）结合增强，可能由于疏水相互作用增加。ssDNA可能以多层方式结合HAP，第一层由静电键主导，后续层由疏水相互作用贡献。温度影响DNA构象及其与CaP的相互作用，低温增强ssDNA稳定性及其与HAP的结合，高温促进更长RNA在HAP上的吸附。矿物性质本身也影响与核酸的相互作用：DNA吸附到草酸钙（calcium oxalate, CaOx）时B螺旋完全失稳，归因于Ox^2?与DNA磷酸骨架之间的排斥效应。DNA序列修饰也影响与CaP的结合。通过指数富集的配体系统进化（SELEX）方法鉴定出高效的CaP结合DNA适配体，其富含鸟嘌呤核苷酸（约43%±9%），并呈现G-四链体结构。核酸与CaP的相互作用并非核酸独有，其他聚阴离子如多聚磷酸盐、糖胺聚糖和酸性多肽也通过磷酸基团与钙离子的静电相互作用。然而，静电相互作用不能完全解释核酸–CaP相互作用，盐依赖性调节表明暴露的核碱基参与的疏水相互作用也有贡献，氢键可能提供额外贡献。这些相互作用的相对重要性受环境条件、核苷酸序列和高级核酸结构调节。RNA由于结构相似性，预计以类似的理化机制与CaP相互作用。

**4 核酸在生物矿化中的潜在参与**

核酸在生物矿化中的可能参与首先预设其以细胞外核酸形式存在于矿化组织中。已在天然小鼠颅骨中鉴定出核酸，并通过同位素标记精确定位于ECM，且非源自细胞裂解。核酸也在多种矿化组织和病理状态中被检测到，如动脉粥样硬化、涎石病和乳腺癌。

**4.1 细胞外核酸**

细胞游离核酸（cell-free nucleic acids, cfNAs）于1948年Mandel和Metais在人类血浆中首次发现，是体液中循环的独立于细胞的核酸，长度约80–200 bp，浓度为10–30 ng/mL，与多种疾病相关并用作诊断生物标志物。细胞外囊泡（EVs）作为分子货物含有核酸，其DNA含量较少，但常携带多种RNA，包括信使RNA、微RNA、转移RNA、核糖体RNA、长链非编码RNA等。中性粒细胞通过NETosis过程释放中性粒细胞胞外陷阱（NETs），由核DNA、线粒体DNA、组蛋白和核内容物衍生蛋白组成。巨噬细胞在特定条件下产生巨噬细胞胞外陷阱（macrophage extracellular traps, METs）。坏死性凋亡（necroptosis）是一种程序性细胞死亡，伴随细胞膜完整性丧失和包括DNA在内的细胞内容物释放。微生物也是细胞外核酸的可能来源，细菌、真核生物和病毒等微生物群释放核酸已有充分记录。

**4.2 病理性矿化**

细胞外核酸的存在在生理条件下可观察到，但在病理条件下通常加剧。软组织异位矿化见于多种病理状态，可影响大多数组织。病理性矿化可形成多种晶体，主要为CaP，还包括焦磷酸钙（calcium pyrophosphates, CaPP）、CaOx、碳酸钙、单钠尿酸盐（monosodium urate, MSU）等。某些病理与基因突变直接相关，多数突变基因编码已知参与矿化调控、磷酸盐稳态或骨骼发育的蛋白质。例如，Aicardi–Goutières综合征中TREX1基因失活突变与基底节钙化相关，胞质核酸积累可能促进异位矿化。病理性矿化也可能涉及细胞外核酸。乳腺癌中的微钙化（图3A）II型由HAP组成，拉曼光谱分析显示大多数样本中存在包封并吸附于HAP的eDNA。涎石（图3B）中也观察到eDNA，多数涎石含有来自口腔和肠道常见微生物组的细菌DNA，且NETs在涎石生长中起重要作用。人主动脉和股动脉粥样硬化病变中的微钙化（图3C）含有eDNA，部分可能源自细菌。感染性心内膜炎与NETs形成相关，动脉粥样硬化病变中也观察到中性粒细胞和NETs，以及含DNA的METs。异位骨化与强烈的免疫反应相关，其特征是中性粒细胞活化和NETosis，使用TLR9（eDNA受体）拮抗剂可显著减少异位骨化。焦磷酸钙沉积病（软骨钙质沉着症）（图3D）中，CaPP晶体诱导NETs形成，可能通过释放eDNA促进炎症持续。坏死性凋亡在肾钙质沉着症（图3E）和骨关节炎（osteoarthritis, OA）（图3F）中观察到，CaP和CaOx晶体诱导坏死性凋亡释放eDNA。凋亡也参与矿化过程，平滑肌细胞（smooth muscle cells, SMC）凋亡释放凋亡小体，早期动脉粥样硬化主动脉中eDNA与死亡细胞共定位。SMCs可转分化为成骨样表型，释放含有核酸的MVs，可能参与囊泡内钙化。OA软骨中软骨细胞发生肥大分化，释放MVs参与软骨矿化。已在异位骨化、血管疾病和钙化性肌腱病中鉴定出EVs。尽管eDNA已在钙化中被观察到，直接证据仍有限。在ApoE^?/?动脉粥样硬化小鼠模型中，DNase处理消除了病变形成；在大鼠主动脉瘤模型中，注射游离DNA诱导主动脉钙化，而无游离DNA注射则未观察到钙化。根据现有证据强度，可将病理条件分为相关性、机制性和因果性联系：乳腺癌为相关性；涎石病和异位骨化为机制性；动脉粥样硬化为因果性；感染性心内膜炎、软骨钙质沉着症、肾钙质沉着症和骨关节炎为相关性。

**5 结论与展望**

生物矿化传统上被视为矿物离子、细胞外基质蛋白、细胞活性和严格调控的理化条件协调作用的过程。现有研究证实了这些既定调节因子的核心重要性，同时揭示该框架可能仍不完整。实验研究表明，核酸可通过静电、疏水及可能的氢键机制与磷酸钙矿物相互作用，具备吸附于CaP表面、影响磷酸钙沉淀、改变晶体生长以及在工程系统中作为矿化结构模板的能力。这些相互作用不仅取决于环境条件，还取决于核酸序列、构象和超分子组织，使其区别于其他带负电的生物聚合物。细胞外核酸是矿化组织的成分，源自多种细胞过程，包括EV分泌、NETosis、坏死性凋亡和微生物活动。病理性矿化提供了令人信服的证据，表明eDNA不仅被掺入钙化灶，还可主动调节其形成。细胞外核酸可能构成连接炎症、细胞死亡、微生物定植和矿物沉积的机制界面。主要挑战包括：核酸是否直接调控生理性生物矿化，或仅在病理条件下发挥显著作用；DNA与RNA、核DNA、线粒体DNA和细菌DNA的各自作用；EVs与游离核酸的相对贡献；序列、化学修饰和高级结构对矿物形成的影响。未来研究需确定核酸如何与胶原纤维、MVs、SIBLING蛋白和PPi代谢等既定调节因子协同作用，以及是否对纤维内和纤维外矿化有不同贡献。整合核酸到当前模型可为骨骼生物学、病理性钙化和生物材料科学提供新研究方向，并可能为生物标志物发现和治疗策略提供新机会。