APM纤毛虫与一种兼性厌氧螺旋纲物种揭示的厌氧纤毛虫（真核生物，泡囊纲）中线粒体相关细胞器的渐进演化轨迹

《Molecular Phylogenetics and Evolution》：Progressive evolutionary trajectories of mitochondrion-related organelles in anaerobic ciliates (Eukaryota, Alveolata) revealed by APM ciliates and a facultatively anaerobic spirotrichean species

　　

### 摘要

纤毛虫是研究原生生物中线粒体向线粒体相关细胞器（MROs）趋同转变的绝佳模型。尽管我们对于纤毛虫MRO中适应性进化的了解日益增加，但在专性厌氧纤毛虫谱系内的渐进式进化轨迹以及兼性厌氧纤毛虫的MRO代谢仍未经探索。在本研究中，我们预测了厌氧单系APM（Armophorea-Muranotrichea-Parablepharismea）演化枝内八个物种以及其姊妹纲Spirotrichea中一个兼性厌氧物种的MRO代谢。我们的主要结果如下：（1）在适应厌氧环境的过程中，APM演化枝内MRO电子传递链（ETC）组分及其相关功能已逐步丧失。（2）Armophorea最后一个共同祖先的MRO可能拥有复合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅴ，但缺乏功能性的复合物Ⅲ和Ⅳ。随后，在适应厌氧环境的过程中，armophorean谱系在Clevelandellida目和Metopida目中进一步丧失了复合物Ⅴ。（3）在兼性厌氧纤毛虫Heterodeviata sinica的MRO中，复合物Ⅲ和Ⅳ缺失，而替代氧化酶（AOX）在适应波动溶解氧水平中发挥了关键作用。（4）融合型[FeFe]-氢化酶似乎是通过水平基因转移（HGT）被纤毛虫最后一个共同祖先获取的，随后经历了多次独立丧失。我们的结果为了解厌氧纤毛虫对低氧环境的渐进式适应提供了见解。

### 引言

大量兼性和专性厌氧的单细胞真核生物（原生生物）在缺氧环境中茁壮成长，它们的线粒体已缩减为多种形态的线粒体相关细胞器（MROs），并利用替代性末端电子受体（Chen et al., 2022, Hackstein, 2018, Leger et al., 2017, Müller et al., 2012）。MRO最初被分类为五种不同类型，即需氧线粒体、厌氧线粒体、产氢线粒体、氢化酶体和胞质体（Müller et al., 2012）。然而，后续发现的中间形式促使人们将MRO视为一种功能和进化上的连续体（Gawryluk et al., 2016）。在过去几十年中，原生生物对低氧浓度的适应以及从线粒体到MRO的趋同转变受到了极大关注（Bu et al., 2023, Chen et al., 2022, De Graaf et al., 2011, Feng et al., 2020, Gawryluk et al., 2014, Hao et al., 2025, Hug et al., 2010, Keeling et al., 2024, Leger et al., 2013, Lewis et al., 2020, Li et al., 2023, Park et al., 2021, Rotterová et al., 2020, Stairs et al., 2015, Xu et al., 2025, Yoshida et al., 2016, Zhao et al., 2024）。

纤毛原生生物广泛分布于各种生境中，包括缺氧环境，它们被认为是研究从线粒体到MRO的进化轨迹的优秀类群（Chen et al., 2022, Lewis et al., 2020, Li et al., 2023, Lynn, 2008, Rotterová et al., 2022, Rotterová et al., 2020）。自由生活和内生生活谱系的厌氧纤毛虫在系统发育树中与其好氧对应类群交错分布，兼性或专性厌氧纤毛虫已在至少14个纲中被报道（Chen et al., 2022, Lynn, 2008, Rotterová et al., 2022）。得益于基因组和转录组数据的积累，对多种厌氧纤毛虫MRO代谢的研究揭示了一系列重要的适应性进化事件，这些事件使它们能够在缺氧环境中生存和产生能量（Bu et al., 2023, Chen et al., 2022, De Graaf et al., 2011, Feng et al., 2020, Lewis et al., 2020, Park et al., 2021, Rotterová et al., 2020, Xu et al., 2025, Zhao et al., 2024）。七个纤毛虫纲内厌氧生物的MRO代谢已被预测，并揭示了电子传递链（ETC）的谱系特异性功能模式（Bu et al., 2023, Chen et al., 2022, De Graaf et al., 2011, Feng et al., 2020, Lewis et al., 2020, Park et al., 2021, Rotterová et al., 2022, Rotterová et al., 2020, Xu et al., 2025, Zhao et al., 2024）。然而，在这七个纤毛虫纲中，每个纲内只有少数厌氧生物被研究，因此厌氧纤毛虫谱系内的渐进式进化适应仍不清楚。此外，兼性厌氧纤毛虫的线粒体可能具有生态和进化上的重要性，使物种能够在波动的溶解氧水平下茁壮成长，并代表着真核谱系适应厌氧生活的进化起点（Gawryluk et al., 2014, Gawryluk and Stairs, 2021）。然而，兼性厌氧纤毛虫的MRO代谢图谱仍缺乏表征。

APM（Armophorea, Parablepharismea, Muranotrichea）纤毛虫为研究厌氧纤毛虫谱系内的渐进式进化适应提供了一个杰出系统。APM纤毛虫是一个完全由专性厌氧生物组成的演化枝，可能起源于一个厌氧自由生活物种（Jiang et al., 2024, Li et al., 2023, Rotterová et al., 2020, Rotterová et al., 2022, Rotterová et al., 2024, Zhang et al., 2025）。APM纤毛虫的祖先可能丧失了一些ETC组分，但仍保留了通过复合物Ⅰ产生质子梯度并随后通过复合物Ⅴ合成ATP的能力（Rotterová et al., 2020）。在APM演化枝内，纲Muranotrichea和Parablepharismea占据最深的位置（Jiang et al., 2024, Li et al., 2023, Rotterová et al., 2024, Rotterová et al., 2020, Xu et al., 2025, Zhang et al., 2025）。一个muranotrichean物种和一个parablepharismean物种的MRO代谢已被报道。这两个物种都保留了通过ETC氧化磷酸化合成ATP的能力，尽管一些ETC组分已丧失（Rotterová et al., 2020）。纲Armophorea包含两个自由生活目（Metopida, Armophorida）和一个内生生活目（Clevelandellida），被认为是最大的厌氧纤毛虫纲（Bourland et al., 2018, Jankowski, 1980, Li et al., 2023）。Metopida目中四个物种和Clevelandellida目中一个物种的MRO代谢已被报道。它们都只保留了ETC复合物Ⅰ和Ⅱ的功能，而丧失了通过氧化磷酸化产生ATP的能力（Chen et al., 2022, De Graaf et al., 2011, Lewis et al., 2020, Rotterová et al., 2020）。所有这些证据表明APM包含具有不同生活方式和显著MRO代谢多样性的厌氧物种。因此，APM纤毛虫是研究MRO渐进式缩减进化的良好模型。然而，由于有限的抽样，它们的MRO进化轨迹仍不清楚。

栖息于氧-无氧界面的兼性厌氧纤毛虫通常能够适应波动的氧分压。兼性厌氧生物的MRO被认为是真核生物适应厌氧生活的起点（Gawryluk and Stairs, 2021）。最近关于兼性厌氧原生生物MRO代谢的研究揭示了多样的能量产生途径，突出了它们对多变氧条件出色的适应能力（Gawryluk et al., 2014, Hug et al., 2010, Leger et al., 2013, Mallo et al., 2013, Mallo et al., 2014, Müller et al., 2012, Perez et al., 2014, Tsaousis et al., 2014, Yoshida et al., 2016）。例如，兼性厌氧的Acanthamoeba castellanii拥有典型线粒体，但在需氧条件下也表现出类似氢化酶体的ATP生成途径（Gawryluk et al., 2014, Hug et al., 2010, Leger et al., 2013）。混合营养藻类Euglena gracilis在需氧条件下可以通过氧化磷酸化产生ATP。然而，在低氧环境中，其线粒体代谢转向苹果酸裂解，同时光合作用和需氧代谢途径均显著减少（Gawryluk and Stairs, 2021, Perez et al., 2014, Yoshida et al., 2016）。尽管兼性厌氧纤毛虫具有重要的生态学意义，但目前对它们在不同氧条件下适应性策略的研究仅限于一个物种，即Philasterides dicentrarchi（纲Oligohymenophorea）。在需氧和厌氧条件下，P. dicentrarchi的生长动力学相似。功能分析表明，P. dicentrarchi拥有两条不同的呼吸途径。一条是细胞色素途径（CP），使用对氰化物敏感的细胞色素氧化酶作为末端氧化酶；另一条是替代途径（AP），使用替代氧化酶（AOX）作为末端氧化酶（Mallo et al., 2013, Mallo et al., 2014）。相比之下，兼性厌氧纤毛虫Holophrya ovum（纲Prostomatea）的MRO代谢图谱仅在厌氧条件下被预测，其对其他氧水平的代谢反应尚未被探索（Xu et al., 2025）。因此，不同溶解氧条件下兼性厌氧纤毛虫的MRO代谢图谱仍属未知。作为APM的姊妹纲，纲Spirotrichea包含需氧和兼性厌氧物种。这些兼性厌氧生物独立于APM纤毛虫经历了向厌氧的进化转变，提供了使用兼性厌氧纤毛虫阐明适应性进化过程的宝贵机会。

在本研究中，我们重建了一棵包括SLAMP纤毛虫（Spirotrichea, Litostomatea, Armophorea, Muranotrichea, Parablepharismea）（Li et al., 2023）的系统发育基因组树。我们新预测了纲Armophorea中七个代表物种和纲Muranotrichea中一个物种的MRO代谢图谱。此外，我们预测了纲Spirotrichea中兼性厌氧Heterodeviata sinica在不同溶解氧条件下的代谢能力。本研究旨在阐明纤毛虫对无氧条件的渐进式进化适应。

### 章节摘要

#### 厌氧纤毛虫的采样与鉴定

在本研究中，采样并新测序了四个物种。本研究使用了与前次研究（Feng et al., 2024）相同的Urostomides minimus种群。Heterodeviata sinica、Heterometopus sp. 和 Muranothrix sp. 的详细采样信息列于表S1。这三个纤毛虫物种基于形态学特征和小亚基核糖体DNA（SSU rDNA）序列进行了鉴定（图S1）。活纤毛虫细胞的形态通过亮场观察...

#### SLAMP纤毛虫的系统发育基因组关系

在系统发育基因组树（图1）中，各个纤毛虫纲的代表物种聚在一起。后鞭体纤毛虫（Heterotrichea + Karyorelictea）在纤毛虫门中占据最基的位置。Intramacronucleata被分为三个不同的分支。它们是CONthreeP（Colpodea, Oligohymenophorea, Nassophorea, Plagiopylea, Prostomatea, 和 Phyllopharyngea）、SLAMP和Protocruziea。

在SLAMP内，Muranotrichea和Parablepharismea互为姊妹关系，然后它们与...

#### APM纤毛虫在厌氧适应过程中ETC功能的渐进丧失

与先前发现一致（Chen et al., 2022, Rotterová et al., 2022, Xu et al., 2025），我们在APM内扩展的抽样进一步显示，厌氧纤毛虫丧失了ETC组分及其相关功能，这可能是对无氧环境的适应，在不同纤毛虫谱系中观察到了不同的丧失模式（图4、图5）。迄今为止，已有来自纲Armophorea和Litostomatea的七个内生共生纤毛虫的MRO代谢途径被报道。MRO代谢...

#### 结论

我们的研究重建了一棵纤毛虫系统发育基因组树和一棵[FeFe]-氢化酶树，并预测了八个APM物种（Brachonella contortus, Heterometopus sp., Metopus major, M. paraes, Muranothrix sp., Nyctotheroides sp., Sulfonecta cf. uniserialis, Urostomides minimus）和来自Spirotrichea的兼性厌氧Heterodeviata sinica的MRO代谢。这些结果为了解厌氧纤毛虫中MRO的渐进式进化轨迹提供了新的见解。我们的结果表明，...

### CRediT作者贡献声明

Jia Li：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 原始草稿，调查，形式分析，数据管理。
Changyu Zhu：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 原始草稿，调查，形式分析，数据管理。
Guoling Chai：撰写 – 审阅与编辑，形式分析，数据管理。
Fangfang He：撰写 – 审阅与编辑，形式分析，数据管理。
Zengyu Song：撰写 – 审阅与编辑，形式分析，数据管理。
Zhicheng Chen：撰写 – 审阅与编辑，形式分析，...

### 未引用参考文献

Fenchel and Finlay (1995).

### 利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本论文所报道的工作。

### 致谢

衷心感谢前中山大学宋李博士和中国海洋大学冯晓辰博士在物种鉴定方面的帮助。我们还感谢华南师范大学现或曾任职的王翠仪、方梦嫣、徐春燕和张倪在数据分析方面的帮助。本工作得到国家自然科学基金委（项目编号32370471, 32070406）和基础与应用基础研究基金...

Jia Li|Changyu Zhu|Guoling Chai|Fangfang He|Zengyu Song|Zhicheng Chen|Miaoying Chen|Zhenzhen Yi
广州亚热带生物多样性与生物监测重点实验室，华南师范大学生命科学学院，广州 510631，中国