多组学整合分析将PAH相关分子特征与胰腺导管腺癌的体细胞突变及基因组复杂性相关联

《HUMAN MUTATION》：Integrated Multiomics Analysis Links PAH-Associated Molecular Features to Somatic Mutation and Genomic Complexity in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

　　

摘要

背景：多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）具有致突变和致癌潜力，但其与胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）中基因组改变以及上皮和间质异质性的关系仍不清楚。

方法：研究人员整合了网络毒理学、病理组学、批量转录组学、单细胞和空间转录组学、免疫分型、蛋白表达、虚拟敲除分析、基因组谱分析和分子对接。将PAH相关PDAC靶基因与导管上皮细胞（ductal epithelial cell，DEC）和癌症相关成纤维细胞（cancer associated fibroblast，CAF）状态相关联。进一步表征了RAC1相关的体细胞突变、肿瘤突变负荷（tumor mutation burden，TMB）、拷贝数改变（copy number alterations，CNAs）和突变特征。

结果：共鉴定出91个PAH相关PDAC靶基因。CTSG、PRKCB、PTPN7和SMO构成四基因PAH相关PDAC靶向衍生保护性基因集（PPTP基因集），与良好的预后和稳定的DEC状态相关，而高RAC1表达与不良预后和CAF重塑相关。RAC1高表达肿瘤表现出更高的TMB，并富集KRAS、TP53、CDKN2A和SMAD4改变。RAC1表达与TMB、CNA负荷和突变特征贡献呈正相关，且在携带KRAS、TP53或CDKN2A突变的肿瘤中表达更高。PPTP表达与基因组复杂性呈负相关。单细胞和空间分析将RAC1与CAF、DEC和免疫重塑相关联。

结论：RAC1表达和PPTP特征识别出具有对比性体细胞突变负荷、驱动基因改变、拷贝数变化、突变特征活性以及上皮和间质组织的不同PDAC状态。这些发现将体细胞突变和基因组复杂性与PDAC中的微环境异质性联系起来。

论文解读：PAH相关分子特征与胰腺导管腺癌体细胞突变及基因组复杂性的多组学整合分析

一、研究背景与科学问题

胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）以显著的组织异质性、复发性基因组改变和复杂的肿瘤微环境为特征。其恶性进展不仅源于肿瘤细胞内部分子异常，还涉及广泛的微环境重塑，包括癌症相关成纤维细胞（cancer associated fibroblast，CAF）活化、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）重组和免疫失调。多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是广泛存在的持久性有机污染物，具有明确的致突变、致癌和基因组损伤潜力，主要来源于煤、石油、木材及生物质的不完全燃烧，也存在于烟草烟雾、汽车尾气和部分加工食品中。既往流行病学研究已提示吸烟、空气污染和职业暴露等环境因素与PDAC风险增加相关，PAHs是其中主要的致癌组分。

然而，PAH相关分子特征与PDAC体细胞基因组改变、上皮状态及间质表型之间的关系仍不清楚。既往研究多在单一数据层面解析PDAC，缺乏将PAH–PDAC靶基因与病理表型、导管上皮细胞（ductal epithelial cell，DEC）和CAF状态、空间组织及基因组改变相整合的分析框架。特别是PAH–PDAC靶基因衍生的分子特征是否与不同的体细胞突变负荷、经典驱动基因改变、拷贝数改变和突变过程相关，以及这些基因组特征如何与上皮–间质异质性、患者预后和免疫微环境相联系，均有待系统阐明。

二、研究内容与主要发现

研究人员整合了网络毒理学、病理组学、批量转录组学、单细胞与空间转录组学、免疫分型、蛋白表达、虚拟敲除分析、基因组改变谱分析和分子对接技术，系统鉴定PAH–PDAC靶基因并表征其形态学、细胞、空间、临床和基因组关联。研究鉴定出91个PAH–PDAC靶基因，发现CTSG、PRKCB、PTPN7和SMO构成的PPTP基因集与良好预后及稳定DEC状态相关，而高RAC1表达与不良预后和CAF重塑相关。RAC1高表达肿瘤显示出更高的TMB、CNA负荷和突变特征贡献，并富集KRAS、TP53、CDKN2A和SMAD4等经典驱动基因改变。PPTP基因集表达则与基因组复杂性呈负相关。该研究发表在《HUMAN MUTATION》。

三、主要关键技术方法

研究基于TCGA-PAAD队列（含全切片图像、转录组和临床数据）、GEO数据库的GSE62452队列及单细胞数据集（6例原发肿瘤和3例正常组织）、空间转录组数据集GSM7498814以及Human Protein Atlas免疫组化数据。主要技术方法包括：网络毒理学预测（TargetNet、SwissTargetPrediction、SEA数据库整合）；基于ResNet-50深度学习与CellProfiler的病理组学特征提取及多算法机器学习建模（MIME1框架，117种算法筛选）；单细胞转录组分析（Seurat、Monocle3拟时序、inferCNV、CommPath与CellChat细胞通讯分析）；RAC1虚拟敲除（scTenifoldKnk）；空间转录组去卷积（RCTD）；基因组改变分析（maftools、GISTIC、非负矩阵分解突变特征提取）；分子对接（CB-Dock2）。

四、研究结果

（一）PAH致癌性预测与PAH–PDAC靶基因鉴定

五种选定PAHs（苯并[a]芘、荧蒽、芴、萘和菲）经ADMETlab 3.0和VenomPred 2.0双平台预测均具有潜在致癌性。整合三个靶点预测平台获得194个PAH潜在靶基因，与GeneCards和OMIM来源的4695个PDAC相关基因取交集后鉴定出91个候选PAH–PDAC靶基因。GO和KEGG富集分析显示这些靶基因显著富集于脂质代谢、外源物应答、DNA损伤修复、凋亡和血管生成等生物学过程。

（二）PDAC病理组学预后模型构建及其与PAH–PDAC靶基因集评分的关联

从组织病理切片中提取CellProfiler常规病理特征和ResNet-50深度学习特征，经Spearman相关分析筛选与PAH–PDAC靶基因集GSVA评分显著相关的特征（FDR < 0.05），再经单因素Cox回归筛选预后相关特征，最终在MIME1框架内确定StepCox（forward）+ Ridge为最优模型。训练集（n = 92）和内部验证集（n = 41）中高风险组总生存期均显著劣于低风险组，0.5、1.5和2.5年时间依赖性ROC曲线下面积均超过0.70。

（三）PAH–PDAC靶基因与病理特征及预后的关联

Spearman相关分析显示所选病理特征与PAH–PDAC靶基因表达存在显著关联。Kaplan–Meier生存分析表明CTSG、PRKCB、PTPN7和SMO高表达与较好总生存期显著相关，而RAC1高表达与较差总生存期显著相关。基于此，CTSG、PRKCB、PTPN7和SMO被组合为PPTP基因集，RAC1因其相反的预后关联及成纤维细胞中显著的表达差异被选为进一步研究靶点。

（四）PDAC单细胞转录组细胞群鉴定及PPTP和RAC1表达模式

单细胞转录组分析鉴定出12个主要细胞群，包括T细胞、B细胞、巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞、成纤维细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、DECs、胰腺上皮细胞、腺泡细胞和胰腺星状细胞。肿瘤组织与正常组织相比，成纤维细胞、DECs和B细胞比例增加，腺泡细胞显著减少。PPTP基因集表达在DECs中显示正常与肿瘤组织间的显著差异，RAC1表达在成纤维细胞中差异最为显著。

（五）CAF和DEC亚群的CNV样转录信号分析

inferCNV分析显示DECs在主要细胞类型中CNV样评分最高。根据PPTP基因集表达将DECs分为Pos.DECs和Neg.DECs，Neg.DECs的CNV样评分显著高于Pos.DECs。CAF再聚类鉴定出三种亚群：抗原呈递CAFs（apCAFs）、炎症性CAFs（iCAFs）和肌成纤维细胞CAFs（myCAFs），其中apCAFs和iCAFs的CNV样评分显著高于myCAFs。RAC1在iCAFs中的表达显著高于myCAFs。

（六）CAF亚群拟时序轨迹

拟时序分析显示myCAFs和iCAFs沿连续轨迹分布，myCAFs主要位于早期拟时序状态，iCAFs主要分布于晚期状态，而apCAFs在拟时序空间中呈相对独立分布，提示其代表一种相对独特的CAF转录状态。

（七）RAC1相关CAF和DEC亚群差异通路富集

CommPath分析显示RAC1.pos.iCAFs富集的代表性通路主要涉及细胞黏附、氧化应激和肿瘤相关代谢过程。Pos.DECs富集通路主要涉及炎症反应和应激适应，Neg.DECs富集通路包括甘油磷脂代谢、黏附连接和Hippo信号通路。

（八）CellChat分析揭示RAC1相关CAF–DEC–免疫通讯模式

RAC1.pos.iCAFs与RAC1.neg.iCAFs相比，向免疫细胞的通讯信号更强，差异通路集中于LAMININ、COLLAGEN、THBS和APP信号通路。RAC1.pos.myCAFs向免疫细胞的通讯主要涉及CXCL、uPA、THBS和ADGRE信号。RAC1.pos.iCAFs与Neg.DECs之间的累积通讯强度高于与Pos.DECs的通讯。Neg.DECs的DEC–免疫中继评分高于Pos.DECs，主要连接的免疫细胞群包括肥大细胞、M1巨噬细胞和M2巨噬细胞，通讯以LAMININ信号通路为主导。

（九）RAC1虚拟敲除揭示ECM、黏附和细胞骨架相关扰动

在RAC1.pos.iCAFs中进行RAC1虚拟敲除后，扰动幅度最大的20个基因包括COL11A1、COL1A1、COL3A1、COL1A2、CTHRC1、COL5A2、COL5A1和THBS2等多个胶原家族基因和ECM结构成分。GO和KEGG富集分析显示这些基因主要富集于胶原纤维组织、ECM组织、ECM–受体相互作用、黏着斑、整合素信号和PI3K–Akt信号通路。Nebulosa密度图显示ECM/胶原相关基因与RAC1在RAC1相关CAF区域存在部分空间重叠和共富集。

（十）基于RCTD去卷积的PDAC空间分布特征

RCTD空间去卷积结果显示RAC1.pos.iCAFs主要分布于神经束周围及上皮–间质界面，RAC1.neg.iCAFs更集中于神经束内部和邻近中央区域。M1巨噬细胞在神经周围区域丰度较高并与RAC1.pos.iCAFs存在部分空间重叠。RAC1.pos.myCAFs主要分布于神经周围和特定间质–神经周围区域。Neg.DECs主要分布于肿瘤病灶内，尤其在下右侧病灶区域信号强度高，Pos.DECs定位于远离主要肿瘤病灶的区域。

（十一）RAC1在PDAC中的预后价值、免疫特征、药物敏感性和蛋白表达模式

TCGA和GSE62452队列中RAC1高表达组总生存期均显著劣于低表达组。免疫浸润分析显示RAC1低表达组中naive B细胞、CD8+ T细胞和静息CD4+ T细胞更丰富，RAC1高表达组中M0巨噬细胞和活化树突状细胞更丰富。免疫功能分析显示RAC1低表达组细胞裂解活性和T细胞共刺激评分较高，高表达组APC共抑制、APC共刺激、MHC I类、副炎症和I型干扰素应答评分较高。药物敏感性预测显示多西他赛、厄洛替尼、长春碱和苏拉明在RAC1高表达组预测IC₅₀较低，SN-38在低表达组预测IC₅₀较低。免疫组化证实PDAC组织中RAC1阳性染色比例显著高于正常胰腺组织。

（十二）基于RAC1表达分层的体细胞突变谱

RAC1高表达组中KRAS、TP53、CDKN2A和SMAD4的突变频率分别为81%、73%、25%和24%，显著高于低表达组。KRAS突变在RAC1高表达肿瘤中检出102例，比值比（odds ratio，OR）为15.238；TP53突变检出92例，OR为6.675。RAC1高表达组TMB显著高于低表达组（p = 2.39 × 10^?6）。突变富集分析显示KRAS、TP53和CDKN2A突变主要富集于RAC1高表达肿瘤。突变互作分析显示两组存在不同的驱动事件共现模式。

（十三）驱动突变模式、预后关联和功能注释

KRAS突变在RAC1高表达肿瘤中检出率80.95%，主要分布于H_N_K_Ras_like结构域；TP53突变检出率73.02%，分布跨越P53_TAD、P53和P53_tetramer功能结构域。Oncodrive分析鉴定出IRS1、U2AF1、KRAS、TIAM1、GNAS等12个显示非随机蛋白结构域聚集特征的突变基因。KRAS/TP53共突变患者总生存期显著差于野生型患者（HR = 2.14）。致癌通路分析显示突变基因主要影响RTK-RAS（72.02%）和TP53（64.88%）通路。药物–基因互作分析将CDKN2A、GNAS、KRAS等归类为临床可操作基因。

（十四）拷贝数改变和突变特征分析

GISTIC分析识别出9p21.3、18q21.2、8q24.21等多个复发扩增和缺失区域。18q21.2缺失和9p21.3缺失频率最高，分别见于68%和63%的样本。8q24.21扩增见于40%的样本。非负矩阵分解提取出两个稳定突变特征，分别与COSMIC SBS1（余弦相似度0.954，与年龄相关内源性突变积累相关）和SBS3（余弦相似度0.735，与同源重组修复缺陷相关）最匹配。

（十五）PAH–PDAC靶基因衍生分子特征与体细胞突变及基因组复杂性的关联

RAC1表达与TMB（rho = 0.475）、CNA负荷（rho = 0.500）、Signature 1贡献（rho = 0.406）和Signature 2贡献（rho = 0.244）均呈显著正相关。PPTP基因集表达与TMB（rho = ?0.417）、CNA负荷（rho = ?0.661）、Signature 1贡献（rho = ?0.263）和Signature 2贡献（rho = ?0.296）均呈显著负相关。RAC1表达在KRAS突变肿瘤（中位7.32 vs 7.23）、TP53突变肿瘤和CDKN2A突变肿瘤中显著升高。PPTP表达在KRAS突变肿瘤中显著降低。91基因PAH–PDAC靶基因集GSVA评分与各项基因组改变指标无显著关联。

（十六）分子对接分析

五种PAHs与CTSG、PRKCB、PTPN7、RAC1和SMO的预测结合亲和力Vina评分均低于?5 kcal/mol，三维对接构象显示PAHs可定位于靶蛋白的预测结合口袋内，主要通过疏水作用和非共价相互作用与周围氨基酸残基形成预测互作网络。

五、讨论与结论

讨论部分指出，RAC1表达与PDAC体细胞基因组 landscape 密切相关。高RAC1表达肿瘤表现出更高的突变负荷并富集经典PDAC驱动改变（尤其KRAS和TP53），提示RAC1标记了一种在更广泛改变的肿瘤基因组背景下出现的转录状态。RAC1高表达肿瘤显示不同的突变互作模式，提示两组不仅在突变积累量上存在差异，在驱动事件的组织方式上也有所不同。RAC1表达与CNA负荷的正相关及其与TMB的关联表明，高RAC1表达识别出在多类改变中基因组复杂性增加的肿瘤。突变特征分析进一步支持RAC1高表达肿瘤以更活跃的肿瘤内在突变过程为特征。相反，PPTP基因集始终与较不改变的基因组背景相关，其良好预后关联更可能源于稳定导管上皮转录状态内的协同共表达，而非统一机制通路。单细胞结果提供了这些对比性基因组状态的细胞学解释：低PPTP表达与显示更强CNV样转录信号和代谢、黏附及Hippo相关可塑性的DECs相关；高RAC1表达主要与成纤维细胞重塑（包括ECM组织、黏着斑、整合素信号和炎症通讯）相关。空间和免疫分析进一步支持这一整合模型：RAC1阳性CAFs富集于上皮–间质界面和神经周围区域，RAC1高表达肿瘤还显示髓系和抗原呈递相关免疫特征的改变。研究同时指出局限性：缺乏患者水平的PAH暴露测量、RAC1分层基于mRNA表达而非突变状态、病理组学模型需独立多中心验证、inferCNV估计的是CNV样转录信号而非直接DNA水平CNA、细胞通讯和虚拟敲除为计算方法需实验验证、空间分析基于单个Visium样本、分子对接预测的相互作用需直接实验证实。

研究结论：通过整合基因组、转录组、单细胞、空间、病理组学和分子分析，本研究识别出具有对比性体细胞基因组背景的不同PDAC分子状态。高RAC1表达与增加的体细胞突变负荷、KRAS/TP53/CDKN2A/SMAD4经典驱动改变富集、更高的CNA负荷和增加的突变特征贡献相关；相反，由CTSG、PRKCB、PTPN7和SMO组成的PPTP基因集高表达与较低的基因组复杂性和相对稳定的导管上皮状态相关。这些对比性基因组状态伴随不同的细胞和微环境特征。RAC1表达和PPTP基因集可能为表征突变相关PDAC状态和指导未来机制研究及患者分层研究提供互补的分子特征。