《Genetics Research》：Integrated Bulk and Single-Cell Transcriptomic Analyses Identify a Five-Gene Signature Associated With Prognosis and the Tumor Microenvironment in Epstein–Barr Virus–Associated Gastric Cancer
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摘要
背景：EB病毒相关胃癌(EBVaGC)是胃癌的一种独特分子亚型，但将EBV相关生物学、预后及微环境重塑联系起来的可靠生物标志物仍然有限。
方法：研究人员从TCGA和GEO数据集中鉴定了与EBVaGC相关的差异表达基因。利用加权基因共表达网络分析和机器
摘要
背景：EB病毒相关胃癌(EBVaGC)是胃癌的一种独特分子亚型，但将EBV相关生物学、预后及微环境重塑联系起来的可靠生物标志物仍然有限。
方法：研究人员从TCGA和GEO数据集中鉴定了与EBVaGC相关的差异表达基因。利用加权基因共表达网络分析和机器学习筛选核心基因。随后进行了功能富集、诊断和预后建模、免疫浸润分析、公共单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据集的单细胞转录组分析、细胞间通讯分析、药物敏感性预测、外部队列验证以及在胃癌细胞系中的RT-qPCR验证。
结果：研究鉴定出五个核心基因(ASPA、CHODL、GNG7、P2RY14和PI16)。组合分类器在发现数据集中显示出较高的表观诊断性能(EBV队列中AUC=1.000，TCGA–STAD中AUC=0.981)，并在GSE27342中保留了判别价值(AUC=0.771)。RT-qPCR证实了这些基因在胃上皮细胞系和胃癌细胞系之间的差异表达，提供了总体肿瘤与正常对照的实验支持而非EBV特异性验证。五基因风险标签对总生存期进行了分层，1年、2年和3年AUC分别为0.634、0.645和0.622，与年龄和分期整合后分别提高至0.716、0.768和0.693。单细胞分析将最强的标签信号定位到成纤维细胞和B细胞，并揭示了肿瘤中MIF、PTN和TNFSF13B相关通讯的增强。高风险肿瘤对紫杉醇和5-氟尿嘧啶的预测IC50值较高。
结论：研究人员鉴定了一个在EBVaGC中具有强大诊断价值和生物学意义的预后相关性的五基因标签，强调了侵袭性疾病中与成纤维细胞和B细胞相关的微环境程序。
论文解读
一、研究背景与问题
胃癌(gastric cancer, GC)是全球最常见的恶性肿瘤之一，也是癌症相关死亡的主要原因。尽管手术、化疗、靶向治疗和免疫治疗不断进步，但由于其显著的分子和临床异质性，胃癌的临床管理仍然面临巨大挑战。具有相似临床病理特征的患者往往预后和治疗反应差异显著，这凸显了传统分期系统在准确反映疾病生物学复杂性方面的局限性。为解决这一问题，分子分型已成为细化胃癌分层的重要框架。癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)将胃癌分为四种分子亚型，即EB病毒(Epstein–Barr virus, EBV)阳性、微卫星不稳定(microsatellite instability, MSI)、基因组稳定(genomically stable, GS)和染色体不稳定(chromosomal instability, CIN)，为在分子水平理解胃癌异质性提供了新基础。
在这些亚型中，EBV相关胃癌(Epstein–Barr virus–associated gastric cancer, EBVaGC)已被确认为一种独特的临床病理实体。EBVaGC的特征是恶性上皮细胞中EBV基因组的单克隆存在，约占所有胃癌的8%–10%。与其他胃癌亚型相比，EBVaGC通常表现出独特的组织学和分子特征，包括淋巴上皮瘤样形态、丰富的免疫细胞浸润以及广泛的表观遗传改变，如广泛的CpG岛超甲基化。这些特征表明EBVaGC不仅是胃癌的组织学变异，而且是由病毒–宿主相互作用、免疫调节改变和表观遗传重塑驱动的生物学上独特的亚型。
已有研究证实EBV感染在胃癌发生和塑造EBVaGC肿瘤微环境中发挥重要作用。与EBV阴性胃癌相比，EBVaGC表现出独特的基因表达模式、免疫激活特征和基质–免疫相互作用。特别是，EBVaGC的免疫富集特性引起了越来越多的关注，表明病毒感染可能不仅影响恶性上皮细胞，还影响周围的成纤维细胞、B细胞和其他免疫细胞区室。然而，尽管已有大量候选基因被报道，但在EBVaGC中，同时可用于诊断、预后信息丰富且与肿瘤微环境机制相关的生物标志物仍然有限。此外，这些标志物背后的细胞背景尚未完全阐明，尤其是在成纤维细胞和B细胞等基质和免疫成分方面。因此，鉴定与EBVaGC密切相关的关键分子标志物并表征其微环境背景，对于提高生物学理解和制定更精准的诊断及预后策略十分必要。
二、研究内容与核心发现
本研究旨在通过整合分析公共转录组数据集来鉴定EBVaGC相关核心基因，并进一步评估其诊断价值、预后意义和肿瘤微环境相关性。研究人员从TCGA和基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus, GEO)获取胃癌转录组和临床数据，其中TCGA–STAD RNA-seq数据作为主要批量转录组队列，GSE51575用于鉴定EBV相关转录改变，GSE27342用于肿瘤与正常组织诊断相关性的外部评估。此外，从GEO获取公共胃癌单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据集GSE275648，用于表征五基因标签的细胞分布和相关的肿瘤微环境背景。
通过差异表达分析、加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis, WGCNA)、随机森林(random forest, RF)和支持向量机–递归特征消除(support vector machine–recursive feature elimination, SVM–RFE)等多种机器学习算法，研究人员最终鉴定出五个核心基因：ASPA、CHODL、GNG7、P2RY14和PI16。组合分类器在发现数据集中显示出较高的表观诊断性能(EBV队列中AUC=1.000，TCGA–STAD中AUC=0.981)，并在GSE27342外部验证队列中保留了肿瘤与正常组织判别价值(AUC=0.771)。RT-qPCR实验证实这些基因在胃上皮细胞系GES-1和胃癌细胞系HGC-27之间的差异表达，提供了总体肿瘤与正常对照的实验支持。预后分析显示，五基因风险标签可对总生存期进行分层，但与年龄和分期整合后预后判别性能提高。单细胞分析将标签信号主要定位到成纤维细胞和B细胞，并揭示了肿瘤中MIF、PTN和TNFSF13B相关细胞间通讯的增强。药物敏感性预测显示高风险肿瘤对紫杉醇和5-氟尿嘧啶的预测IC50值较高。
该研究发表在《Genetics Research》期刊上。研究的意义在于提供了一个具有强诊断价值和生物学意义的预后相关五基因标签，揭示了EBVaGC侵袭性疾病中与成纤维细胞和B细胞相关的微环境程序，为EBVaGC的生物标志物研究和精准治疗策略开发提供了新视角。
三、主要技术方法
研究人员使用了以下关键技术方法：从TCGA和GEO数据库获取批量转录组数据及公共scRNA-seq数据集GSE275648（包含11个直接提交样本）；利用limma包进行差异表达分析；采用WGCNA构建共表达网络并筛选与EBV感染和肿瘤状态相关的关键模块；整合RF和SVM–RFE两种机器学习算法进行特征选择；通过受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线评估诊断效能；采用Cox比例风险回归构建预后风险模型；利用单样本基因集富集分析(single-sample Gene Set Enrichment Analysis, ssGSEA)、MCPcounter和ESTIMATE算法评估免疫浸润；使用Seurat v5包进行单细胞转录组数据分析，采用CellChat包推断细胞间通讯；通过oncoPredict包基于GDSC数据库预测化疗药物敏感性；使用RT-qPCR在GES-1和HGC-27细胞系中进行表达验证。
四、研究结果
1. EBV和肿瘤状态相关的常见差异表达基因鉴定
在TCGA–STAD数据集中，与正常对照相比，肿瘤组织中共鉴定出2497个下调和2220个上调基因。在GSE51575队列中，鉴定出1587个与EBV阳性状态相关的下调和1090个上调基因。通过交集分析，确定了TCGA和GEO数据集共有的696个常见下调和521个常见上调基因。
2. 交集基因的功能富集分析
KEGG富集分析显示，常见上调基因显著富集于细胞周期、细胞因子–细胞因子受体相互作用和PI3K–Akt信号通路。相反，常见下调基因主要与代谢通路相关，如视黄醇代谢和酪氨酸代谢。
3. WGCNA关键模块鉴定
在GEO数据集中，选择软阈值功率β=5以满足无标度拓扑。ME3模块与EBV感染呈最强正相关(R=0.87, p<0.01)，ME2模块呈强负相关。TCGA队列平行分析采用β=3，发现紫色模块(R=0.55, p<0.01)等多个模块与肿瘤状态显著相关。将高相关模块中的基因与先前鉴定的常见DEGs取交集，以确保同时具有差异表达和网络水平显著性。
4. 机器学习筛选核心基因
对于GEO_EBV数据集，RF和SVM–RFE确定了30个重叠基因作为核心特征；TCGA_STAD数据集中，两种模型一致筛选出24个基因。两个队列特征基因的交集最终产生5个核心生物标志物：ASPA、CHODL、GNG7、P2RY14和PI16。
5. 核心生物标志物的诊断效能
在内部发现队列中，五个核心生物标志物在组间均显著差异表达。组合多基因分类器在GEO_EBV队列中AUC=1.000，TCGA–STAD队列中AUC=0.981，表现出极佳的判别能力。单个标志物也显示出较强的诊断性能。
6. 诊断价值的外部验证
在GSE27342外部验证队列中，五个核心生物标志物在肿瘤和正常组织间均保持显著差异表达，表达模式与TCGA队列一致。组合五基因分类器保留了判别价值(AUC=0.771)。RT-qPCR结果显示ASPA、CHODL、GNG7、P2RY14和PI16在HGC-27细胞中相对GES-1细胞显著失调，总体表达趋势与转录组结果一致，提供了细胞系水平的一般性支持。
7. 预后意义和风险模型构建
在TCGA–STAD队列中进行的KM生存分析显示，PI16、GNG7、ASPA、P2RY14和CHODL的高表达与较短的总生存期显著相关。多变量Cox模型构建的风险标签将患者分为高风险和低风险组，高风险组OS显著较差(p<0.0001)。时间依赖性ROC分析显示基因组模型预测性能中等，1年、2年和3年AUC分别为0.634、0.645和0.622。整合风险评分与年龄和分期后，结合临床–基因组模型的AUC提高至0.716、0.768和0.693。在314例患者(111例死亡)中，表观C指数TNM分期为0.628，年龄+分期为0.663，五基因模型为0.607，组合模型为0.694。
8. 免疫浸润图谱
GEO_EBV队列中，EBV阳性肿瘤显示多种免疫细胞群富集显著增加，包括活化B细胞、活化CD4 T细胞、活化树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞和多个记忆T细胞亚群。五个核心基因与免疫细胞丰度广泛正相关，尤其是活化/记忆T细胞、B细胞和树突状细胞区室。TCGA–STAD队列中，高风险组表现出肥大细胞、活化树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞和多个活化/记忆T细胞亚群富集增加。风险评分与大多数免疫细胞群正相关。
9. 单细胞表征和细胞通讯
对GSE275648中11个直接提交样本进行严格质控和降维后，鉴定出21个细胞簇，注释为七种主要细胞谱系：上皮细胞、T细胞、NK细胞、髓系细胞、B细胞、成纤维细胞和内皮细胞。相对细胞比例分析显示肿瘤组织中上皮细胞和T细胞显著扩增。特征图显示GNG7和P2RY14主要定位于特定基质细胞簇，PI16在成纤维细胞亚群中富集表达。整合的五基因模块评分在成纤维细胞和B细胞中显著富集。
10. 肿瘤微环境中细胞通讯网络的改变
CellChat分析显示肿瘤组织中整体通讯格局显著重塑。传出信号分析显示，成纤维细胞在肿瘤状态中占据突出的信号发送者位置，通过MIF–(CD74+CXCR4)、MIF–(CD74+CD44)和PTN–NCL信号轴与多种免疫细胞群增强通讯。传入信号分析确定B细胞为肿瘤中的重要接收群体，TNFSF13B通过TNFRSF17、TNFRSF13C和TNFRSF13B介导的信号以及MIF–(CD74+CXCR4)相互作用在肿瘤B细胞中显著富集。
11. 化疗敏感性预测
共有86种化合物在高低风险组间预测药物敏感性存在显著差异。与低风险组相比，高风险肿瘤样本对紫杉醇和5-氟尿嘧啶的估计IC50值显著较高，表明预测敏感性降低，而顺铂无显著差异。风险评分与紫杉醇和5-氟尿嘧啶的IC50值正相关，与顺铂弱负相关。
五、讨论与结论
研究人员指出，鉴于以往研究已确立EBVaGC不仅具有分子独特性，还具有免疫独特性，本研究发现的EBV和肿瘤相关共享基因富集于细胞周期、细胞因子–细胞因子受体相互作用和PI3K–Akt通路，而代谢程序受抑制，支持EBV相关胃癌发生源于增殖信号、炎症激活和代谢重塑的汇聚这一模型。
五个核心基因的已知功能支持了该标签的生物学相关性。ASPA编码天冬氨酸酰基转移酶，在前列腺癌和肝细胞癌等癌症中与细胞增殖、侵袭和免疫浸润相关；GNG7是异三聚体G蛋白γ亚基，在胃癌中通常被视为肿瘤抑制分子，可抑制细胞周期进程并促进凋亡；CHODL编码跨膜黏附相关蛋白，其异常表达或甲基化与多种实体瘤的进展和生存相关；P2RY14是UDP-糖响应性嘌呤能受体，参与炎症信号和免疫细胞趋化；PI16被认为是特化成纤维细胞群的标志物，PI16阳性成纤维细胞可促进免疫抑制和治疗抵抗。
免疫浸润分析有助于解释为何免疫富集表型不一定转化为一致的有利结果。高风险组的特征不仅是免疫浸润增加，还包括肥大细胞、巨噬细胞、活化树突状细胞、CD56bright NK细胞和活化/记忆T细胞亚群的富集，符合炎症肿瘤仍可能功能受限或具有抑制性的概念。单细胞结果进一步指向成纤维细胞为中心的信号传导是这种重塑的主要组成部分。风险评分集中在成纤维细胞和B细胞中，PI16在成纤维细胞亚群中富集，成纤维细胞在肿瘤组织中充当主要信号发送者。CellChat分析强调了肿瘤状态中MIF–(CD74+CXCR4)、MIF–(CD74+CD44)、PTN–NCL和TNFSF13B相关信号增强，支持成纤维细胞–免疫串扰而非单纯上皮表达驱动了标签的预后影响这一观点。
药物敏感性分析提示，高风险肿瘤对紫杉醇和5-氟尿嘧啶的预测敏感性降低，与基质重塑和免疫抑制伴随药物耐药的观点一致。临床上，五基因标签可能更有价值于识别生物学侵袭性、微环境主导的肿瘤，而非直接指导化疗获益。
研究结论：研究人员鉴定了一个与互补的EBV相关和胃肿瘤相关特征相关的五基因转录组标签，该标签在各队列中表现出稳健的诊断性能，并提供了生物学上可解释的预后分层。整合的批量及单细胞分析进一步表明，不良风险表型与成纤维细胞和B细胞相关的微环境重塑以及细胞间通讯改变有关，支持EBVaGC未来的生物标志物研究。
