《Food Science & Nutrition》：Investigation of the Mechanism of Total Flavonoids From Chuju in Mitigating Cerebral Ischemia–Reperfusion Injury in Rats Using Untargeted Metabolomics
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滁菊（*Dendranthema morifolium* (Ramat.) Tzvel. cv.）是一种兼具药用和食用价值的传统中草药。因其富含黄酮类和多糖类化合物，滁菊被广泛用于茶饮和功能食品。研究人员前期的研究表明，滁菊总黄酮（total flavon
滁菊（*Dendranthema morifolium* (Ramat.) Tzvel. cv.）是一种兼具药用和食用价值的传统中草药。因其富含黄酮类和多糖类化合物，滁菊被广泛用于茶饮和功能食品。研究人员前期的研究表明，滁菊总黄酮（total flavonoids of Chuju, TFCJ）可减轻大鼠脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia–reperfusion injury, CIRI）。然而，TFCJ所调控的潜在代谢通路尚不清楚，其治疗靶点也需要进一步研究。本研究旨在阐明TFCJ的神经保护机制。液相色谱-质谱联用（LC–MS）分析在TFCJ中鉴定了42种化合物。动物实验表明，TFCJ显著减小脑梗死体积，提高脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的水平，并降低丙二醛（MDA）的含量。非靶向代谢组学分析提示，TFCJ通过调节三羧酸（tricarboxylic acid, TCA）循环、糖酵解、磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway, PPP）以及天冬氨酸-谷氨酸代谢来发挥其保护作用。通路分析揭示，4EBP1/eIF4E信号通路可能介导了TFCJ的保护作用。总之，本研究分析了TFCJ的主要成分，并提供证据表明4EBP1/eIF4E信号通路可能是其对抗CIRI的神经保护作用的潜在中介。这些发现为TFCJ作为功能食品和药物制剂的应用提供了理论基础。
**论文解读文章**
**一、研究背景与问题**
脑卒中是全球范围内导致残疾和死亡的主要原因之一，给医疗系统和患者家庭带来了沉重的经济负担。缺血性卒中（ischemic stroke, IS）约占所有脑血管事件的75%至85%，其致死率、致残率均较高，超过70%的幸存者会丧失独立生活能力。目前，静脉溶栓和血栓切除术是IS的主要临床治疗手段。然而，恢复缺血脑组织的血流并不总能逆转可逆性损伤，反而可能加剧神经元凋亡和坏死等不可逆损伤，这种现象被称为脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia–reperfusion injury, CIRI）。CIRI是IS中的关键病理过程，其机制复杂，涉及缺血缺氧、氧化应激、能量代谢紊乱及多种细胞死亡途径。
滁菊（*Dendranthema morifolium* (Ramat.) Tzvel. cv.）是产于安徽滁州的一种道地药食两用植物，位居中国“四大药用菊花”之首。滁菊富含黄酮类、多糖和挥发油等成分，被广泛用于滁菊酒、滁菊茶等功能产品。药理学研究表明，滁菊具有抗心肌缺血、降血糖、抗炎和抗氧化等活性，其中黄酮类化合物被认为是其主要生物活性成分。研究人员前期工作已证实，滁菊总黄酮（total flavonoids of Chuju, TFCJ）通过抑制氧化应激和细胞凋亡，有效保护大鼠免受CIRI损伤。然而，TFCJ成分多样，具有多靶点、多通路作用的特点，除抗氧化和抗炎作用外，其对细胞代谢关键节点的调控作用以及通过调节能量代谢反应发挥神经保护效应的机制尚未完全阐明。因此，开展本研究以揭示TFCJ潜在的代谢调控通路与治疗靶点。
**二、研究内容与结论**
本研究建立了大鼠大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）模型，评估TFCJ对CIRI的神经保护作用。研究人员通过神经功能评分、TTC染色、HE染色和尼氏染色评估了TFCJ对脑梗死体积和组织病理损伤的影响，并检测了脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性和丙二醛（MDA）含量以评估抗氧化能力。利用UHPLC-Q-TOF-MS非靶向代谢组学技术检测各组大鼠脑组织代谢物变化，并进行通路富集分析和Western blot验证。研究结果表明，TFCJ显著减小脑梗死体积，改善神经功能缺损，减轻神经元损伤，并增强抗氧化能力。代谢组学分析显示TFCJ通过调节三羧酸循环、糖酵解、磷酸戊糖途径及天冬氨酸-谷氨酸代谢来发挥保护作用。Western blot结果提示4EBP1/eIF4E信号通路可能介导了其神经保护效应。该研究发表在《Food Science》。
**三、关键技术方法**
本研究采用大鼠MCAO模型模拟CIRI，模型制备参考Wu等的方法，术后24小时进行神经功能评分。研究设置了假手术组（Sham）、模型组（MCAO）及TFCJ低（25 mg/kg）、中（50 mg/kg）、高（100 mg/kg）剂量组和阳性对照血塞通组（XST，25 mg/kg），每组9只SPF级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，购自杭州医学院实验动物中心（生产许可证号：SCXK（浙）2019-0002）。TFCJ经70%乙醇超声提取、D101大孔吸附树脂纯化获得，总黄酮含量为85.58%（以芦丁计），并采用液相色谱-质谱联用（LC–MS）对其化学成分进行鉴定。神经功能评分采用盲法评估；脑梗死体积通过TTC染色和ImageJ软件测量；组织病理学检查采用HE染色和尼氏染色；抗氧化指标按试剂盒说明测定；代谢组学分析采用UHPLC-Q-TOF-MS技术，数据经预处理后进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA），以VIP>1、p<0.05且q<0.05筛选差异代谢物，并通过MetaboAnalyst进行通路富集分析；Western blot用于验证信号通路相关蛋白表达。
**四、研究结果**
**4.1 TFCJ的化学成分**
通过LC–MS分析，从TFCJ中共鉴定出42种化合物，包括芹菜素-7-O-葡萄糖苷（apigetrin）、木犀草素（luteolin）、黄芩苷（baicalin）、圣草酚（eriodictyol）等。这些化合物已被广泛研究证明具有抗炎、抗氧化和神经保护等药理活性。
**4.2 TFCJ对CIRI大鼠的神经保护作用**
采用MCAO大鼠模型评估TFCJ对CIRI的作用。与Sham组相比，MCAO组大鼠神经功能评分显著升高，脑梗死体积达37.14%。与MCAO组相比，TFCJ各剂量组脑梗死体积均显著减小，且呈剂量依赖性，表明TFCJ对大鼠CIRI具有保护作用。
**4.2.1 TFCJ减轻CIRI大鼠组织损伤并增强抗氧化能力**
HE染色结果显示，MCAO组神经元数量显著减少，细胞排列紊乱，出现核固缩深染和细胞周围空泡化；TFCJ治疗显著改善了这些组织病理学改变。尼氏染色显示，模型组神经元胞体固缩、形态不规则，尼氏体数量显著减少，部分神经元坏死溶解；TFCJ治疗改善了神经元形态，恢复了尼氏体数量。氧化应激指标检测显示，与Sham组相比，模型组脑组织SOD活性和GSH-Px水平显著降低，而MDA含量显著升高。与MCAO组相比，TFCJ中、高剂量组SOD和GSH-Px水平显著升高，MDA含量显著降低。结果表明TFCJ增强了CIRI大鼠的抗氧化能力。
**4.3 代谢组学分析**
**4.3.1 PLS-DA分析**
PLS-DA得分图显示，QC样本紧密聚集，表明实验稳定性良好。Sham组和Model组显著分离，表明缺血再灌注诱导了显著的代谢扰动。TFCJ处理组沿横轴呈正向逐步分布，提示代谢改变存在潜在剂量依赖性趋势。TFCJ-H组（HD）聚类最接近Sham组，表明高剂量治疗使代谢谱更接近正常状态。置换检验（n=200）的R2值为0.0至0.252，Q2值为0.0至-0.429，表明PLS-DA模型稳定可靠，无过拟合现象。
**4.3.2 差异代谢物热图**
采用VIP>1、p<0.05和q<0.05的筛选标准，共鉴定出25种差异代谢物，包括富马酸、柠檬酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、2-氧代戊二酸、谷氨酰胺和N-乙酰-L-天冬氨酸等。热图直观展示了这些代谢物在不同实验组中的表达变化模式。
**4.3.3 富集分析**
富集分析结果显示，受影响的主要通路涉及氨基酸代谢和能量代谢，包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、TCA循环、精氨酸生物合成、丁酸代谢、磷酸戊糖途径、丙酮酸代谢、糖酵解/糖异生以及谷胱甘肽代谢。
**4.4 TFCJ通过4EBP1/eIF4E信号通路在CIRI大鼠中发挥保护作用**
通过MetScape插件和Pathway Commons数据库进行通路富集分析，富集到的eIF4信号轴是PI3K/Akt/mTOR通路的下游组成部分，涉及mTOR介导的4EBP1磷酸化，进而释放并激活eIF4E。研究人员此前已证明TFCJ通过PI3K/Akt/mTOR通路发挥神经保护作用（Wang, Chen, et al. 2021）。Western blot检测结果显示，与Sham组相比，模型组p-4EBP1和eIF4E蛋白水平显著降低；而TFCJ治疗部分逆转了这些变化，增加了p-4EBP1和eIF4E蛋白水平。结合既往发现，表明TFCJ可能通过4EBP1/eIF4E信号通路在CIRI大鼠中发挥保护作用。
**五、讨论与结论**
讨论部分指出，TFCJ显著减小脑梗死体积并减轻缺血再灌注诱导的神经元丢失，同时增强SOD和GSH-Px活性、降低MDA水平，表明其神经保护作用部分由抗氧化防御机制介导。代谢紊乱是CIRI诱导神经损伤的重要因素。脑组织代谢高度活跃，消耗近20%的葡萄糖衍生能量，TCA循环和氧化磷酸化产生超过90%的总能量。在IS中，TCA循环通量中断会减少ATP产生并促进神经元死亡。本研究中MCAO大鼠TCA循环中间产物（柠檬酸、富马酸、琥珀酸、α-酮戊二酸）水平显著降低，而磷酸烯醇式丙酮酸和乳酸水平升高，乳酸/丙酮酸比值增加，提示缺氧条件下糖酵解的代偿性上调。TFCJ治疗部分逆转了这些变化，使代谢物水平更接近Sham组，表明改善了能量供应并发挥神经保护作用。磷酸戊糖途径（oxidative branch）产生NADPH，对维持氧化还原稳态至关重要。MCAO大鼠G6P、D-葡糖酸-1,5-内酯和6-磷酸-D-葡糖酸水平升高，提示缺血再灌注后PPP代偿性上调。TFCJ治疗进一步增加了这些代谢物，表明增强了PPP活性并改善了抗氧化能力。此外，模型组谷氨酰胺和N-乙酰-L-天冬氨酸水平降低，谷氨酸水平升高；TFCJ治疗显著增加了谷氨酰胺和N-乙酰-L-天冬氨酸水平并降低了谷氨酸水平，支持TFCJ在增强抗氧化能力和神经保护方面的作用。研究人员既往报道TFCJ上调PI3K-Akt-mTOR通路中的p-AKT和p-mTOR。mTORC1调节细胞生长、蛋白质合成和自噬，对神经元存活和可塑性至关重要。本研究代谢组学分析提示TFCJ改善了TCA循环、糖酵解、PPP和氨基酸代谢相关代谢谱，Western blot证实TFCJ逆转了CIRI诱导的p-4EBP1和eIF4E蛋白水平降低，与mTORC1/4EBP1/eIF4E轴激活一致。但当前证据为相关性证据，未来需使用4EBP1特异性siRNA或mTOR抑制剂（如雷帕霉素）进行功能性验证，以建立通路激活与TFCJ神经保护作用之间的因果关系。
结论部分：综上所述，TFCJ给药通过改善能量供应和抗氧化能力，显著减轻了CIRI诱导的神经损伤。代谢组学分析显示，TFCJ通过上调TCA循环、糖酵解、磷酸戊糖途径、天冬氨酸代谢和谷氨酸代谢等通路，恢复了CIRI大鼠脑组织的代谢谱。此外，研究结果表明，TFCJ激活4EBP1/eIF4E信号可能是其在缺血组织中保护神经细胞的潜在机制。这些发现为TFCJ改善大鼠CIRI的机制提供了新的认识，并为治疗方法提供了有价值的线索和新视角。
