《JOURNAL OF APPLIED TOXICOLOGY》：Toll-Like Receptors in the Mechanism of Hexabromocyclododecane-Induced Production of Pro-Inflammatory Cytokines
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六溴环十二烷（HBCD）是一种溴化阻燃剂，因其在人体组织中的生物蓄积性及诱导促炎性细胞因子的能力而日益引发健康关注。白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是炎症的主要介质，其慢性升高与自身免疫性疾病、心血管疾
六溴环十二烷（HBCD）是一种溴化阻燃剂，因其在人体组织中的生物蓄积性及诱导促炎性细胞因子的能力而日益引发健康关注。白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是炎症的主要介质，其慢性升高与自身免疫性疾病、心血管疾病和癌症相关。既往研究已提示丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）是HBCD诱导IL-1β和IL-6产生的介质。由于MAPKs作用于Toll样受体（TLRs）（关键的炎症反应调节因子）的下游，因此确定TLRs是否参与HBCD驱动的炎症至关重要。本研究考察了TLR1/2、TLR2、TLR3、TLR4和TLR8在HBCD诱导外周血单个核细胞（PBMCs）产生IL-1β、IL-6和TNF-α中的作用。研究人员将PBMCs预先用靶向TLR1/2（CUCPT 22）、TLR2（C29）、TLR3（CUCPT 4a）、TLR4（TAK-242）、TLR8（CUCPT 9a）和MyD88（TJ-M2010-5）的选择性抑制剂处理，随后暴露于HBCD（1–5 μM）。结果表明，抑制TLR4可显著降低HBCD诱导的所有三种细胞因子的产生，证明其在该反应中的核心作用。阻断TLR8可显著降低HBCD诱导的IL-1β产生。相比之下，抑制TLR1/2、TLR2或TLR3对HBCD诱导的细胞因子产生未见一致性影响。抑制TLR相关衔接蛋白MyD88可显著减弱HBCD诱导的IL-1β和IL-6产生，而TNF-α产生未受到一致性影响。这些结果进一步阐明了HBCD导致人类免疫细胞促炎性细胞因子产生升高的机制。
**论文解读：六溴环十二烷通过Toll样受体4介导人类免疫细胞促炎性细胞因子产生的机制研究**
**一、研究背景与目的**
慢性炎症是一种在缺乏感染或损伤情况下持续存在的炎症反应，在自身免疫性疾病、癌症、心血管疾病和代谢综合征等多种重大健康问题的发生与发展中发挥关键作用。慢性炎症的特征性表现是白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等关键促炎性细胞因子的持续升高，这些细胞因子通过驱动炎症反应，促进组织损伤、自身免疫和肿瘤进展。Toll样受体（TLRs）是先天免疫系统的重要组成部分，负责识别病原体相关分子模式（PAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs）。TLRs被激活后，通过髓样分化初级反应蛋白88（MyD88）等衔接蛋白启动下游信号级联反应，激活核因子-κB（NF-κB）和激活蛋白1（AP-1）等转录因子，进而促进促炎性细胞因子的表达。TLR信号通路可激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路，特别是细胞外信号调节激酶（ERK1/2）和p38 MAPK通路，最终诱导IL-1β、IL-6和TNF-α等强效炎症细胞因子的产生。
六溴环十二烷（HBCD）是一种具有生物蓄积性的溴化阻燃剂，广泛用于建筑材料保温、家具衬垫以及电器和电子产品外壳等工业材料。已有研究表明，HBCD可通过MAPK依赖性机制增加人类外周血单个核细胞（PBMCs）中IL-1β和IL-6的产生，并能以MAPK依赖性方式增加人类免疫细胞的TNF分泌。近期研究进一步证实，HBCD暴露可同时增加IL-1β和IL-6的分泌水平和细胞内水平（即产生量），且已确定MAPKs在HBCD诱导的细胞因子产生中发挥关键作用。然而，尽管MAPK激活已被证实，但作为MAPK激活上游调节因子的TLRs在HBCD诱导细胞因子产生中的作用仍不清楚。
值得注意的是，戊氯酚（PCP）、三丁基锡（TBT）和二丁基二氯化锡（DBT）等环境污染物已被证明能以MAPK依赖性方式增加人类PBMCs中IL-1β和IL-6的产生，其中PCP涉及TLR4和TLR8，TBT涉及TLR4、TLR1/2和TLR8。鉴于TLR激活是MAPKs和炎性细胞因子产生的主要调节因素，且结构相似的环境污染物使用TLR依赖性机制，确定HBCD诱导的炎症是否通过特定TLR通路介导至关重要。因此，本研究旨在探讨TLR1/2、TLR2、TLR3、TLR4和TLR8以及MyD88在HBCD诱导人类PBMCs产生IL-1β、IL-6和TNF-α中的作用，以阐明HBCD免疫毒性的分子机制。
**二、主要关键技术方法**
研究人员从田纳西州纳什维尔红十字会血库设施获得的白细胞滤器中分离PBMCs。研究中使用了多种选择性抑制剂，包括TLR1/2抑制剂CUCPT22、TLR2抑制剂C29、TLR3抑制剂CUCPT4a、TLR4抑制剂TAK-242、TLR8抑制剂CUCPT9a以及MyD88抑制剂TJ-M2010-5。细胞先用特异性抑制剂或相应对照处理1小时，随后暴露于不同浓度HBCD（1、2.5和5 μM）24小时。分泌型细胞因子水平采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测，细胞内细胞因子水平采用western blot分析。此外，研究人员还进行了分子对接研究，使用AutoDock软件将HBCD对接到人类TLR4/MD-2信号复合物（PDB登录号：3FXI）中，以预测其结合模式。统计分析采用Student's t检验，并通过Bonferroni–Holm方法进行I型错误校正。
**三、研究结果**
**1. TLR1/2抑制对HBCD诱导IL-1β、IL-6和TNF-α产生的影响**
来自四个不同供体的PBMCs实验显示，所有供体来源的细胞在HBCD暴露后IL-1β、IL-6和TNF-α产生均增加，但反应幅度因供体和浓度而异。TLR1/2抑制并未一致性地减弱HBCD诱导的IL-1β、IL-6和TNF-α产生。部分供体细胞中TLR1/2抑制反而增强了HBCD诱导的细胞因子产生。这些结果表明TLR1/2并未持续参与介导HBCD暴露后的IL-1β、IL-6和TNF-α产生。
**2. TLR2抑制对HBCD诱导IL-1β、IL-6和TNF-α产生的影响**
使用TLR2选择性抑制剂C29处理后，TLR2抑制并未一致性地减弱HBCD诱导的IL-1β、IL-6和TNF-α产生。部分供体细胞中HBCD刺激的IL-1β产生在TLR2被抑制时显著降低，但另一些供体细胞在抑制剂存在下IL-1β产生反而增强。不同供体间结果不一致，表明TLR2在HBCD诱导的IL-1β、IL-6和TNF-α产生中不具有一致性作用。
**3. TLR3抑制对HBCD诱导IL-1β、IL-6和TNF-α产生的影响**
使用高选择性TLR3抑制剂CUCPT4a处理后，TLR3抑制并未一致性地改变HBCD诱导的IL-1β产生。虽然一个供体的HBCD刺激IL-1β增加被TLR3抑制显著降低，但另两个供体在TLR3被抑制时HBCD刺激的IL-1β产生反而增强。TLR3抑制同样未能一致性地抑制HBCD增加IL-6或TNF产生的能力。
**4. TLR4抑制对HBCD诱导IL-1β、IL-6和TNF-α产生的影响**
与前述TLRs不同的是，TLR4抑制剂TAK-242处理一致性地降低了HBCD诱导的IL-1β、IL-6和TNF-α产生增加。在多个供体来源的PBMCs中，TAK-242均能显著降低HBCD刺激的IL-1β产生，且在所有测试浓度下均显著降低IL-6产生。TNF-α产生在5和2.5 μM HBCD暴露时也被TLR4抑制显著降低。多个供体和浓度下观察到的一致降低支持TLR4参与介导HBCD刺激的PBMCs中IL-1β、IL-6和TNF-α产生。
**5. TLR8抑制对HBCD诱导IL-1β、IL-6和TNF-α产生的影响**
使用TLR8选择性抑制剂CUCPT9a处理后，TLR8抑制在多个供体中降低了HBCD诱导的IL-1β产生。相比之下，TLR8抑制并未一致性地减弱HBCD增加IL-6或TNF-α产生的能力。因此，TLR8在介导HBCD诱导的IL-1β产生中发挥作用，但在HBCD刺激的IL-6和TNF-α产生中未表现出一致性作用。
**6. MyD88抑制对HBCD诱导IL-1β、IL-6和TNF-α产生的影响**
使用MyD88抑制剂TJ-M2010-5处理后，MyD88抑制在多个供体中降低了HBCD诱导的IL-1β和IL-6产生，而TNF-α产生受到的影响较不一致。在IL-1β产生方面，所有供体在2.5 μM HBCD暴露后均出现细胞因子水平升高，MyD88抑制剂的存在使这些增加显著降低。IL-6产生方面也观察到类似趋势。相比之下，MyD88抑制仅在部分供体中降低了HBCD刺激的TNF-α产生，在其他供体中未引起变化。
**7. ERK1/2通路和p38抑制对HBCD诱导TNF-α产生的影响**
使用MAPK/ERK激酶（MEK）抑制剂PD98059抑制ERK1/2通路后，该抑制并未一致性地阻断HBCD诱导的TNF-α产生增加，表明ERK1/2通路激活并非HBCD刺激TNF-α产生的驱动因素。相比之下，使用p38抑制剂SB202190后，p38抑制一致性地减弱了HBCD诱导的TNF-α产生增加。多个供体和浓度下观察到的显著降低支持p38 MAPK信号通路在介导HBCD刺激的PBMCs中TNF-α产生中发挥核心作用。
**8. HBCD与TLR4的分子对接**
分子对接研究表明HBCD能够在MD-2共受体形成的脂质结合口袋中与TLR4相互作用。双网格对接方法以0.500 ?的网格间距采样TLR4/MD-2表面，两个网格盒的对接结果均收敛于MD-2共受体内的同一预测结合位点。上结构域网格中最低能量簇含100次对接运行中的24次，平均结合能为?7.4 kcal/mol，代表性构象结合能为?7.42 kcal/mol，估计抑制常数（Ki）为3.62 μM。下结构域网格的优势簇含100次对接运行中的30次，平均结合能同样为?7.4 kcal/mol，最高排名构象结合能为?7.43 kcal/mol，估计Ki为3.59 μM。预测结合位点均位于MD-2的疏水空腔内，周围4 ?半径内的氨基酸残基包括Arg106、Asp99、Asp100、Lys72和Gly97。
**四、讨论与结论**
TLRs是模式识别受体家族，在免疫细胞和组织细胞上表达，识别病原体来源的保守分子基序（PAMPs）以及受损细胞释放的内源性危险信号（DAMPs）。TLR激活后通过MyD88或TRIF等衔接蛋白启动信号级联反应，激活下游激酶和转录因子（MAPKs和NF-κB），进而驱动促炎性基因的表达。由于TLRs是炎症的关键守门人，它们代表了环境污染物破坏免疫稳态的脆弱界面。HBCD已被归类为持久性有机污染物，其使用在许多国家受到限制或禁止，但现有污染和该化学品的长期环境寿命意味着人类暴露仍在持续。HBCD已在多种人体组织和血液中被检测到，甚至可穿过胎盘屏障影响胎儿发育。本研究中使用的HBCD浓度高于人类血清中测量水平，但在最低测试浓度50 nM（接近血清中测量水平）时已观察到HBCD诱导的促炎性细胞因子增加。
本研究结果表明，TLR4在HBCD诱导的IL-1β、IL-6和TNF-α产生中发挥核心作用。TLR4抑制一致性地降低了多种实验条件下的细胞因子产生，表明HBCD通过与TLR4相关的通路激活炎症信号。TLR8特异性参与IL-1β产生，提示细胞内TLR信号在调节选择性细胞因子反应中的作用。相比之下，TLR1/2、TLR2和TLR3的抑制未一致性地影响细胞因子产生，表明这些TLRs不是HBCD诱导炎症反应的主要介质。MyD88抑制一致性地阻碍了HBCD刺激IL-1β和IL-6产生的能力，证实了MyD88偶联的TLRs（如TLR4和TLR8）在HBCD升高这些细胞因子中的作用。TNF-α产生受MyD88抑制的影响较不一致，提示HBCD诱导的TNF-α产生可能涉及额外信号机制。分子对接研究表明HBCD与TLR4/MD-2受体复合物在MD-2疏水空腔内相互作用，与PCP和TBT等疏水性污染物通过疏水口袋与TLR4相互作用的研究结果一致。
TLR激活通过MyD88等衔接蛋白导致下游信号传导，进而激活MAPK通路和促炎性细胞因子的转录。本研究表明p38抑制可显著降低HBCD诱导的TNF-α产生，而ERK1/2抑制反而导致细胞因子产生增加，提示MAPK信号通路内存在复杂的调节或补偿机制。这些发现对慢性炎症和公共卫生具有重要意义。HBCD通过持续升高免疫细胞的促炎性细胞因子产生，具有充当慢性炎症刺激物的能力。研究表明阻断TLR4可显著降低HBCD诱导的IL-1β、IL-6和TNF-α升高，阻断TLR8可降低HBCD诱导的IL-1β产生。MyD88抑制后IL-1β和IL-6的一致降低表明这些细胞因子主要通过MyD88依赖性TLR信号通路调控。TNF-α产生在MyD88抑制后未被一致性地减弱，提示HBCD诱导的TNF-α表达可能部分独立于MyD88，TRIF介导的信号或其他平行通路可能补偿MyD88功能的丧失。这些发现为HBCD诱导免疫激活的分子机制以及环境污染物如何通过TLRs驱动炎症提供了重要见解。
