负载精油的壳聚糖纳米颗粒在体外引发尖孢镰刀菌的细胞膜破坏和氧化崩溃

《Physiological and Molecular Plant Pathology》：Essential-oil-loaded chitosan nanoparticles trigger membrane disruption and oxidative collapse in Fusarium oxysporum in vitro

　　

摘要

尖孢镰刀菌是一种破坏性的土壤传播病原体，可导致多种作物维管束枯萎病并造成大量产量损失。对合成杀菌剂使用限制的日益严格，迫切需要更安全和可持续的替代品。本研究开发了一种抗菌生物纳米技术平台，将香菜（Coriandrum sativum）和薄荷（Mentha piperita）精油（EO）包封于壳聚糖纳米粒子中，以提高精油的稳定性并延长其抗菌活性。精油通过水蒸气蒸馏法提取，并使用气相色谱-质谱联用法进行表征，鉴定出芳樟醇为香菜精油的主要成分，薄荷醇和薄荷酮为薄荷精油的主要成分。载精油壳聚糖纳米粒子通过乳化-离子凝胶法制备，以三聚磷酸钠为交联剂，并通过动态光散射、Zeta电位分析、傅里叶变换红外光谱和X射线衍射进行表征。红外吸收峰的偏移和结晶度的降低证实了精油的成功包封以及精油成分与壳聚糖基质之间的相互作用。两种配方均表现出双相释放特征，即初始突释后进入持续释放阶段，72小时内累计释放率达85-90%。载薄荷精油纳米粒子的释放行为最为可控。所有处理均以浓度和时间依赖的方式抑制真菌生长。游离薄荷精油活性高于香菜精油，而纳米包封显著增强了两种精油的疗效。载薄荷精油壳聚糖纳米粒子抑制分生孢子萌发率达98.8%，最低杀菌浓度仅为280 ppm，最短杀菌时间为5.8小时。该配方将孢子活力降至0.8%，并显著增加膜通透性（OD260=0.98）、蛋白泄漏（108.5 μg mL?1）、核酸泄漏（OD280=1.01）和电解质泄漏（97.8%），表明真菌膜完整性广泛丧失。它还诱导严重氧化应激，将细胞内活性氧增加至对照的498.7%，过氧化氢积累至12.84 μmol g?1鲜重，丙二醛含量增至17.41 nmol g?1鲜重。尽管超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶活性在中等浓度下初期升高，但在杀菌浓度下急剧下降，表明过量氧化应激压倒了真菌抗氧化防御系统。扫描电子显微镜进一步揭示了纳米粒子处理后菌丝严重变形、收缩和结构坍塌。将精油与阳离子壳聚糖纳米粒子结合，实现了可控释放，增强了膜破坏和氧化损伤，加速了真菌灭活。因此，该平台代表了控制尖孢镰刀菌和其他植物病原真菌的一种有前景的可持续替代品。

引言

尖孢镰刀菌是一种破坏性的土壤传播病原体，在全球范围导致多种作物枯萎病，往往造成毁灭性产量损失。例如，在番茄中，番茄尖孢镰刀菌（F. oxysporum f. sp. lycopersici）可导致10-80%的产量损失，对农民生计构成严重威胁（Muhorakeye et al., 2024）。该病原体侵入寄主维管束组织并产生耐性的厚垣孢子，可在土壤中持续长达十年，使其极难根除（Muhorakeye et al., 2024）。传统上，种植者依赖化学杀菌剂（苯菌灵、多菌灵）进行镰刀菌防治，但其效力正在减弱，缺点也日益明显。大量使用杀菌剂导致抗性菌株的出现，并对环境和健康影响引起严重担忧（Muhorakeye et al., 2024）。事实上，监管和消费者压力正在增加以限制合成农药的使用——例如，欧盟绿色协议目标是到2030年将化学农药减少50%（Petrovi? et al., 2025）。在此背景下，迫切需要可持续、生态友好的传统杀菌剂替代品（Muhorakeye et al., 2024）。

植物来源的精油已成为填补这一需求的有前景的生物农药。这些天然产物主要由挥发性萜烯和酚类组成，具有广谱抗菌活性，同时可生物降解且对非靶标生物安全（Arora et al., 2022）。与单作用位点的合成杀菌剂不同，植物精油通常通过多种作用模式攻击病原体，从而降低抗性发展的风险（Arora et al., 2022）。香菜（C. sativum）和薄荷（M. piperita）精油尤其因其抗菌潜力而引人注目。两者均富含生物活性单萜（香菜中的芳樟醇和薄荷中的薄荷醇），可破坏真菌细胞膜和代谢过程。近期研究证实了这些精油对抗镰刀菌的有效性。D?n?等人（2021）发现，在足够浓度下，香菜籽油在体外完全抑制了镰刀菌分离株的菌丝生长（Weisany et al 2022a, 2022b）。同样，Pérez-Vázquez等人（2022）表明，薄荷油（及其主要成分薄荷醇和薄荷酮）可抑制辣椒果实的镰刀菌腐烂，显著延迟储存条件下的病害发展（Pérez-Vázquez et al., 2022）。这些发现表明，植物精油可作为强效抗菌剂。然而，精油在作物保护中的实际应用面临挑战：精油挥发性极高，具有强烈气味，且在暴露于环境因素时可能不稳定（Weisany et al., 2019）。

为克服这些局限性，研究人员正在探索纳米包封技术，特别是使用壳聚糖作为载体，以配制更有效的基于精油的杀菌剂（Weisany et al., 2022b; Yousefi et al., 2024）。壳聚糖是一种由几丁质衍生的可生物降解多糖，被公认安全（GRAS）且具有固有抗菌性。将精油包封在壳聚糖纳米粒子中可保护挥发性生物活性化合物免受快速蒸发和降解，同时提供抗菌成分随时间的可控释放（Arabpoor et al., 2021; Weisany et al., 2024b）。实际上，纳米包封稳定了油脂并延长其作用，解决了游离精油快速消散的问题。壳聚糖本身对防御做出贡献：它是阳离子的，可与真菌细胞壁相互作用，并具有固有的抗菌和抗细菌特性（Dhlamini et al., 2024）。此外，基于壳聚糖的纳米载体具有生物相容性且无毒残留，符合对环境无害的作物处理需求。近期进展表明，精油-壳聚糖纳米系统协同增强抗菌效力。例如，将薄荷油、牛至油或肉桂油纳入壳聚糖纳米粒子中，使这些油脂更稳定，并与未包封的油脂相比显著增强其杀菌活性（Sonar et al., 2023）。纳米配方控制活性分子的释放，通常减少植物毒性或刺激效果，从而提高精油的安全性（Yousefi et al., 2024）。实际上，壳聚糖包封的精油配方在多项研究中表现优于游离油：例如，包封的丁香油在体外表现出比游离丁香油更强的真菌生长抑制作用。通过利用壳聚糖基质的保护和递送功能，这些纳米复合材料确保在病原体附近更长的时间内维持精油生物活性成分更高的局部浓度。

尽管香菜（C. sativum）和薄荷（M. piperita）精油、壳聚糖纳米粒子及其各自的抗菌特性已知，但本研究的新颖性在于将这两种化学性质不同的精油共同包封在单一可生物降解壳聚糖纳米载体中，并将其可控释放行为与针对尖孢镰刀菌的抗菌作用进行全面的多水平研究联系起来。据我们所知，这种双载配方对真菌杀灭动力学、膜完整性、氧化代谢、抗氧化防御和细胞超微结构的影响尚未在单一实验框架内得到系统研究。纳米载体的设计旨在改善精油分散性和理化稳定性，减少快速挥发，提供持续释放，从而促进活性成分与真菌细胞之间的延长接触。除展示增强的抗菌效力外，本研究通过整合时间-杀伤动力学、分生孢子萌发和孢子活力测定、膜通透性测量、细胞内蛋白和核酸相关物质泄漏、电解质泄漏、活性氧和过氧化氢积累、脂质过氧化、抗氧化酶反应和超微结构分析来阐明相关机制。因此，研究目标为：(i) 合成并全面表征共同负载香菜和薄荷精油的壳聚糖纳米粒子；(ii) 比较双载配方与相应游离精油的释放行为和抗菌效力；(iii) 确定其增强的杀菌作用是否源于协同膜破坏、氧化应激诱导、抗氧化防御崩溃和真菌细胞结构损伤。通过将纳米配方特征和持续释放与多种机制终点联系起来，本研究推进了对基于精油的抗菌递送的理解，并为开发用于镰刀菌相关植物疾病管理的可生物降解纳米平台提供了实验基础。

章节片段

植物材料和真菌菌株

香菜（C. sativum L.）和薄荷（M. piperita L.）的鲜叶采集自埃及开罗大学的认证有机农场。植物材料由埃及开罗大学植物科学系植物学家根据标准形态特征（叶片形状、气味和腺毛结构）进行鉴定。标本（CS-2025和MP-2025）保存在系标本馆以供参考。叶片经清洗，室温晾干……

细胞内活性氧（ROS）

细胞内ROS积累使用荧光探针2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）测定，按照已建立的方法进行并略作修改（Oiki et al., 2022）。将约100 mg新鲜真菌菌丝与10 μM DCFH-DA在磷酸盐缓冲盐水（PBS；pH 7.4）中于28 °C暗处孵育30 min。孵育后，用PBS洗涤菌丝三次以去除多余探针。荧光强度使用……测量。

精油从纳米壳聚糖制剂中的体外释放行为

壳聚糖纳米粒子中香菜和薄荷精油的释放曲线展示在图2中。两种配方均表现出双相释放模式，以初始突释阶段开始，随后在72小时内进入持续和可控释放阶段（图2）。在前几个小时，观察到精油的快速释放，这可归因于表面相关油分子的扩散。载香菜精油纳米粒子显示出略快的初始释放……

讨论

理化表征为理解生物学反应提供了结构基础。动态光散射确认了纳米尺度的形成和狭窄的尺寸分布，而精油纳入后的中等尺寸增加与疏水分子在基于壳聚糖的纳米载体内成功包封/内载一致，这通常表现为精油纳入后尺寸增大（Yousefi et al., 2024）。均匀的粒子尺寸至关重要……

结论

本研究证明，对抗尖孢镰刀菌的抗菌活性源于精油（EO）组成、壳聚糖固有生物活性和纳米粒子介导的递送的共同作用。两种游离精油均以浓度和时间依赖方式抑制真菌生长。薄荷油表现出更大的固有活性，可能是由于其薄荷醇和薄荷酮丰富的组成能够与真菌膜快速相互作用并破坏真菌膜。香菜……

资助

作者声明本研究、撰写和/或发表获得财务支持。本研究由沙特阿拉伯利雅得努拉公主本特阿卜杜勒阿齐兹大学研究人员支持项目（编号PNURSP2026R148）资助。

CRediT作者贡献声明

Alya Aljuaid：方法论。Samah H. Albehaijani：方法论，调查。Shouaa Abdulaziz Alrobaish：撰写——初稿。Najeeb M. Almasoudi：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿。Rasha Assad Assiri：验证，软件。Mona H. Soliman：撰写——审阅与编辑，监督，方法论。Mohamed M. Hassan：软件，方法论。Abeer S. Alqurashi：撰写——初稿，数据整理。Alaa Baazeem：撰写——初稿，方法论。

数据可用性

数据可应作者要求提供。

代码可用性

不适用。

伦理批准

本研究不需要伦理批准。

利益冲突

作者声明无利益冲突。

出版同意

所有作者同意。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本报告中所述工作。

致谢

沙特阿拉伯利雅得努拉公主本特阿卜杜勒阿齐兹大学研究人员支持项目（PNURSP2026R148），努拉公主本特阿卜杜勒阿齐兹大学。

Alya Aljuaid | Samah H. Albehaijani | Shouaa Abdulaziz Alrobaish | Mohamed M. Hassan | Abeer S. Alqurashi | Alaa Baazeem | Najeeb M. Almasoudi | Rasha Assad Assiri | Mona H. Soliman

沙特阿拉伯沙克拉大学科学与人文学科学院生物系，11961，沙克拉。