基于环介导等温扩增的侧向流层析检测（LAMP-LFA）快速检测稻伪黑穗病菌 Ustilaginoidea virens

《Physiological and Molecular Plant Pathology》：Rapid detection of rice false smut fungus Ustilaginoidea virens by loop-mediated isothermal amplification-based lateral flow assay (LAMP-LFA)

　　

摘要

稻曲病由病原菌Ustilaginoidea virens引起，显著降低了水稻的产量和质量。由于U. virens侵染植物的方式独特，有效管理该病原菌极具挑战性。因此，需要能够早期检测和监测的技术，以限制病害的扩散。环介导等温扩增与侧向流层析试纸法相结合，克服了现有U. virens检测方法的缺点——这些方法通常速度慢、成本高昂、依赖复杂的实验室设备，且容易产生假阳性结果。在本研究中，我们选择了U. virens特有的Uvβ1基因作为检测试剂开发的目标。我们开发的修饰引物成功鉴定了U. virens DNA，且与近缘病原菌无交叉反应。在优化的反应条件下，该检测方法表现出高灵敏度，可检测低至100?fg的U. virens DNA。此外，通过使用缓冲液提取粗病原菌DNA，LAMP-LFA在64分钟内即可在水稻谷粒中鉴定出U. virens，无需专用设备。因此，结果表明LAMP-LFA是一种灵敏、快速且用户友好的诊断工具，具有用于田间监测、早期病害诊断和有效管理病害爆发的强大潜力，从而有助于减少产量损失。

引言

水稻（Oryza sativa L.）是全球大量人口的主要口粮，提供全球饮食能量的20% [1]。然而，水稻易感多种病害，总计超过70种，由真菌、细菌、病毒和线虫等各种生物因子引起。其中，稻曲病是由Ustilaginoidea virens（有性阶段：Villosiclava virens）引起最具破坏性的病害，造成15至30%的严重产量损失，年经济损失约330亿美元 [2]。早期，该病害在水稻产区被认为是偶发的；然而，由于杂交稻广泛种植、化肥过量使用和气候变化等因素，其经济重要性日益上升，影响了全球的水稻种植 [3]。在泰米尔纳德邦，该病害的发生率约为6%至36% [4]。U. virens的感染影响多种籽粒品质参数，尤其对营养品质有明显影响 [5]。该病原菌侵染水稻小穗，提取养分，导致形成黄色至绿黑色的稻曲球，内含粉状的厚垣孢子 [6]。因此，需要一种简单、高效、快速的方法来在田间检测和鉴定U. virens。

各种分子检测技术，如常规PCR、巢式PCR和实时PCR，已被开发用于精确鉴定稻曲病 [7]。然而，制备、扩增和分析样品所需昂贵的实验室设备限制了这些技术在现场条件下的使用。相比之下，利用等温扩增的分子检测方法已成为可行的替代方案，包括最常用基于核酸序列的扩增方法，如环介导等温扩增（LAMP）和重组酶聚合酶扩增（RPA）[8,9]。这些技术不需要昂贵且专业的设备，在现场条件下非常有效。

特别是，LAMP检测在65?°C的恒定反应温度下运行，仅需极少资源和时间（30至60分钟），为医学、农业和兽医学等多个领域的病原体现场检测提供了简单快速的方法 [10]。LAMP检测结果会积累副产物，表现为白色沉淀或颜色变化，可通过目视评估。LAMP-LFA技术将LAMP与侧向流层析试纸法相结合，创建了一种便携、精确、快速且用户友好的方法 [11]。该方法主要用于对健康构成重大威胁的病原体，如流感病毒 [12]。关于其在植物病原体中的应用报告较少，如Rhizoctonia solani、Candidatus Liberibacter asiaticus和Xanthomonas oryzae pv. oryzae [11,13,14]。

在我们的研究中，我们探索了LAMP与LFA的结合，该方法效率更高、耗时更少，并具有田间应用的潜力。本研究的主要目标是：(i) 验证所开发的基于LAMP的检测方法在感染小穗中检测稻曲病病原菌的有效性；(ii) 实施并使用LFA试剂盒验证所开发的LAMP方案；(iii) 直接从粗提取物中快速检测U. virens。

各章节摘要

U. virens的分离

本研究中使用真菌、卵菌和细菌分离株详见表2、表3。所有10个U. virens分离株均从表现出典型稻曲病症状（黄色或绿色稻曲球）的感染稻穗中分离而来，这些稻穗采自印度泰米尔纳德邦的各个水稻种植区。分离过程包括使用1%次氯酸钠处理稻曲球表面灭菌45秒，再用70%乙醇处理45秒，随后进行三次无菌

LAMP检测的验证

LAMP检测在65?°C下进行60分钟，以验证所设计的引物与所有10个U. virens分离株的反应。所有10个分离株均呈现天蓝色，而阴性对照显示紫色（图1）。

LAMP-LFA的最优条件

为确定LAMP-LFA的最优条件，优化了引物浓度、MgSO₄浓度、反应温度和持续时间。每项评估均进行三次独立的生物学重复。用最明亮的检测条带通过肉眼判断

讨论

稻曲病由U. virens引起，已成为全球水稻种植的重大问题 [3,24]。感染发生在小穗仍在发育、受精前的孕穗期，高湿和凉爽条件促进菌丝生长。因此，降雨是水稻病害爆发期间的一个因素 [25]。为制定合适的防控策略，必须考虑病原菌、水稻生长阶段和降雨情况。虽然后两者

结论

总之，所开发的LAMP-LF检测方法提供了一种快速、灵敏且有效的方法，可在实验室和田间条件下检测稻曲球、无症状稻谷和小穗中的U. virens。U. virens已知在孕穗期感染水稻小穗，症状在水稻抽穗期显现。因此，在症状出现前在水稻小穗中早期检测U. virens有助于制定管理

CRediT作者贡献声明

Thanga pandiyan Tamil Mani：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，可视化，验证，资源，方法论，数据整理，概念构思。Kamalakannan Ayyanar：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，验证，指导，资源，项目管理，方法论，资金获取，数据整理，概念构思。Balasubramaniam Parameswari：验证，指导，资源，概念构思。Chellappan Gopalakrishnan：方法论，

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不适用。

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资金支持

本工作由Anusandhan国家研究基金会（ANRF）（新德里）资助（项目编号：CRG/2022/006273-G）。作者Kamalakannan Ayyanar已获得ANRF新德里的研究支持。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在可能影响本论文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

作者感谢国家研究生奖学金（NSP）和新德里Anusandhan国家研究基金会（ANRF）提供的资金支持。

Thanga pandiyan Tamil Mani|Kamalakannan Ayyanar|Balasubramaniam Parameswari|Chellappan Gopalakrishnan|Subramanian Rajesh|Duraisamy Ladhalakshmi|Govindan Muthukumar

印度，哥印拜陀，泰米尔纳德农业大学，植物病理系