基于GC-MS的内生木霉属asperellum菌株代谢物谱分析及针对尖孢镰刀菌番茄专化型致病性相关效应蛋白的分子对接研究

《Physiological and Molecular Plant Pathology》：GC–MS-based profiling and molecular docking of metabolites from indigenous Trichoderma asperellum against virulence associated effector proteins of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici

　　

## 摘要

番茄（*Solanum lycopersicum* L.）是一种具有重要经济价值的蔬菜作物，深受尖孢镰刀菌番茄专化型（*Fusarium oxysporum* f. sp. *lycopersici*，Fol）引起的镰刀菌枯萎病的严重影响。本研究评价了本地木霉菌分离株对Fol的拮抗活性，并采用生化和计算生物学方法对拟康氏木霉（*Trichoderma asperellum*）Ta-02中的选择性化合物进行了表征。基于形态学特征和ITS-rDNA序列分析，鉴定出六株本地木霉菌分离株，分别为康氏木霉（*T. asperellum*，Ta-02和Ta-08）、哈茨木霉（*T. harzianum*，Ta-03、Ta-06和Ta-09）以及深绿木霉（*T. atroviride*，Ta-05）。在所评价的分离株中，康氏木霉Ta-02对Fol-04表现出最大的拮抗活性，双培养抑制率为73.43%，在最高浓度的培养滤液条件下毒饵试验抑制率为100%，挥发物介导的互作抑制率为63.07%。Ta-02粗提物的FTIR分析表明存在多种官能团，而GC-MS分析初步鉴定出十种化合物。正十六酸（棕榈酸）的色谱丰度最高，而间苯二甲酸三正十酸酯在评价的化合物中对所选Fol效应蛋白的预测结合亲和力最为有利。分子对接预测该化合物与SIX6的结合能为?8.71 kcal·mol?1，与Avr1（SIX4）的结合能为?10.93 kcal·mol?1，与Avr3（SIX1）的结合能为?10.04 kcal·mol?1。正模式分析提供了对接复合体预测结构动态的补充计算信息。在盆栽条件下，Ta-02相较于接种对照减少了病害进展，其病害面积平均动态进展（AUDPC）为16.00，病害减少率为71.43%，同时促进了植物生长、生物量和果实产量。总体而言，微生物学、化学分析、计算生物学和盆栽试验的综合结果支持了本地康氏木霉Ta-02作为番茄镰刀菌枯萎病生物防治剂的潜力。仍需进一步的实验研究来确认GC-MS检测到的各组分的身份、生物活性及其具体的分子作用。

## 引言

番茄（*Solanum lycopersicum* L.）是全球栽培最广泛、经济价值最高的蔬菜作物之一，这得益于其高营养和商业价值。它是维生素、矿物质、膳食纤维和抗氧化化合物（包括番茄红素、β-胡萝卜素和抗坏血酸）的优质来源，这些物质对人体健康和营养贡献巨大。然而，番茄生产受到多种生物胁迫的严重影响，其中由尖孢镰刀菌番茄专化型引起的镰刀菌枯萎病被认为是全球最具毁灭性的土传病害之一[1,2]。该病的特征表现为严重的维管束枯萎、叶片黄化、生长受阻和最终植株死亡，造成巨大的经济损失。在田间条件下，产量损失可达25%至55%，而在极为有利的环境条件下，发病率可能高达90%[3,4]。该病原菌的管理特别具有挑战性，原因是其通过厚垣孢子在土壤中可长期存活，且存在多种致病小种并表现出高度的遗传变异性[5,6,7]。

镰刀菌枯萎病的管理主要依赖于合成杀菌剂和土壤熏蒸剂的应用。然而，化学农药的持续和不加选择的使用引发了严重的环境和公共健康担忧[8]。尽管化学杀菌剂可以抑制病害发展，但它们往往只能提供部分控制效果，并可能促进镰刀菌抗药性菌株的出现。此外，杀菌剂残留会负面影响土壤微生物多样性，破坏生态平衡，并对食品安全构成风险，从而限制了化学病害管理策略的长期可持续性[9,10]。公众对环境污染和农药相关健康风险的日益关注，进一步加速了对环境友好和可持续病害管理替代方案的探索[6,7]。

在众多生物防治剂中，木霉属（*Trichoderma*）物种因其对多种植物病原菌的广谱拮抗活性而备受关注。木霉属真菌被认为是高效的生物防治真菌，具有快速生长、强大的根际竞争力和高效的植物根系定殖能力[11]。其生物防治活性通过多种机制实现，包括菌体寄生、营养和空间竞争、水解酶分泌、抗生物质产生以及诱导寄主植物系统抗性[12,13]。多项研究表明，木霉属物种能有效降低镰刀菌枯萎病的严重程度，同时促进植物生长、营养吸收和作物整体产量[14,15]。此外，结合减少剂量杀菌剂与木霉属物种的综合病害管理策略已显示出减少化学投入同时维持有效病害控制的潜力[11]。

木霉属的抗真菌潜力主要归因于其产生多种多样的次级代谢产物和挥发性有机化合物（VOCs）[16]。这些代谢产物具有强大的抗菌、抗氧化和植物生长促进特性，在抑制土传病原菌方面发挥着关键作用。此前的研究已鉴定出木霉属产生的超过100种生物活性代谢物和抗生素化合物，包括脂肪酸、醇类、萜类、肽类、吡酮类、酚类和挥发性碳氢化合物[17,18]。木霉属释放的挥发性代谢物可以抑制真菌生长、干扰病原菌信号通路并激活植物防御反应，从而为可持续的病害管理策略作出贡献[14,19]。

代谢组学技术的最新进展使得真菌次级代谢产物及其生物学功能的全面表征成为可能。在现有的分析技术中，气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）已成为分析木霉属产生的挥发性和非挥发性代谢物的最有效工具之一。GC-MS有助于鉴定与抗真菌和抗氧化活性相关的众多生物活性化合物[16]。此外，傅里叶变换红外光谱（FTIR）可提供真菌代谢物中官能团的宝贵信息，从而支持抗真菌化合物的生化表征。因此，GC-MS和FTIR分析的结合对于理解木霉分离株的代谢物多样性和生物活性潜力变得越来越重要[18]。

在分子水平上，尖孢镰刀菌番茄专化型的致病性与其分泌效应蛋白密切相关，特别是分泌于木质部（SIX）蛋白，这些蛋白促进了寄主的定殖和病害发展。理解病原菌效应蛋白与抗真菌代谢物之间的相互作用可能为抑制病害的机制提供新的见解[20,21]。分子对接等计算方法已成为预测配体-蛋白质相互作用和鉴定靶向真菌毒力相关蛋白的潜在抑制化合物的有力工具。因此，将代谢组学分析与分子对接分析相结合，可能更深入地了解木霉来源代谢物对镰刀菌枯萎病病原菌的抑制潜力[22]。

鉴于上述背景，本研究旨在从番茄根际土壤中分离和鉴定本地木霉属物种，并评价其对尖孢镰刀菌番茄专化型的拮抗潜力。研究还旨在利用FTIR和GC-MS分析调查这些分离株产生的挥发性和非挥发性代谢物，并通过分子对接方法评估所鉴定代谢物与真菌效应蛋白之间的相互作用。这种综合性调查可为开发基于代谢物的环境友好型策略以实现番茄镰刀菌枯萎病的可持续管理作出贡献。

## 根际土壤样本采集

2023–2024种植季期间，从印度泰米尔纳德邦的主要番茄种植区（包括丹卡尼科泰、帕拉科德、卡里曼加兰、阿蒂穆甘、达哈普拉姆、梅切里、奥丹查特拉姆、维达桑杜尔、卡马奇普兰和瓦杜加帕蒂）采集根际土壤样本。选点依据为番茄的连续种植和镰刀菌枯萎病的普遍发生。从健康番茄植株根部0–20 cm深度采集附着的根际土壤。

## 番茄根际土壤本地木霉菌分离株的分布与分离

从印度泰米尔纳德邦主要番茄种植区采集的根际土壤中总共分离出十株本地木霉菌，根据其各自的分离地点分别编号为Ta-01至Ta-10（表1）。分离株分别来自丹卡尼科泰、帕拉科德、卡里曼加兰、阿蒂穆甘、达哈普拉姆、梅切里、奥丹查特拉姆、维达桑杜尔、卡马奇普兰和瓦杜加帕蒂（图1）。所采集的土壤主要由红壤质粘土、红沙土、红土和黑土组成。

## 本地木霉菌分离株的分布与分离

本研究从印度泰米尔纳德邦主要番茄种植区采集的番茄根际土壤中分离出十株本地木霉菌，其种群密度范围为3.2×10?至6.0×10? CFU·g?1土壤。帕拉科德（Ta-02）的种群密度最高，其次为卡里曼加兰（Ta-03）和达哈普拉姆（Ta-05），表明木霉菌的丰度随当地土壤特性和农业生态条件的变化而变化。类似的区域变异性

## 结论

本研究证明了本地木霉菌属物种在生物防治番茄镰刀菌枯萎病（由尖孢镰刀菌番茄专化型引起）方面的潜力。在所评价的分离株中，康氏木霉Ta-02在体外条件下表现出最大的拮抗活性，并在盆栽条件下展现出最强的病害抑制和植物生长促进作用。FTIR分析表明粗提物中存在多种官能团。

## 未来展望

未来的研究应着重于通过多地点田间试验验证康氏木霉Ta-02的效能，并开发适用于大规模应用的稳定商业制剂。需要先进的代谢组学和转录组学方法来鉴定活性抗真菌化合物并阐明其分子作用机制。需要对预测的蛋白质-配体相互作用进行实验验证，同时评估根际定殖能力、环境

## CRediT作者贡献声明

K. Vigneshwaran：撰写—审阅与编辑，撰写—原始草稿，可视化，软件，资源，方法学，数据管理，概念化。K. Rajamohan：验证，监督，项目管理，调查，获取资金，概念化。K. Balamurugan：可视化，软件，资源，方法学，数据管理。N.H. Shankar Reddy：软件，资源，方法学。P. Sivasakthivelan：验证，监督，数据管理，概念化。Shraddha

## 资金支持

作者声明与本研究中提及的任何商业实体无财务关系。

## 利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争财务利益或个人关系。

## 致谢

作者衷心感谢印度奇达曼巴拉姆安纳马莱大学农学院植物病理学系主任提供的必要设施。同时感谢安纳马莱大学植物病理学系研究生S. Jeevanantham在分子对接和模拟软件方面的协助。特别感谢Sanjana S.博士（MD，外部疗法）提供的技术支持。

K. Vigneshwaran | K. Rajamohan | K. Balamurugan | N.H. Shankar Reddy | P. Sivasakthivelan | Shraddha Bhaskar Sawant

印度泰米尔纳德邦奇达曼巴拉姆安纳马莱大学农学院植物病理学系，邮编608 002