全面rep-PCR分析揭示印度来源的玉米迪西耶氏菌分离株的遗传多样性，并开发一种用于玉米细菌茎腐病早期检测的敏感BIO-PCR检测方法

《Physiological and Molecular Plant Pathology》：Comprehensive rep-PCR analysis reveals genetic diversity among Dickeya zeae isolates from India and development of a sensitive BIO-PCR assay for early detection of maize bacterial stalk rot

　　

摘要

细菌茎腐病（BSR），由 Dickeya zeae（玉米软腐欧氏菌）引起，是全球玉米生产面临的新兴威胁。然而，关于印度 D. zeae 种群的遗传多样性及可靠分子检测方法的资料仍然有限。本研究利用 REP、ERIC 和 BOX 引物，通过基于重复序列的 PCR（rep-PCR）技术，对来自印度四大玉米种植区（特伦甘纳邦、德里、喜马偕尔邦和北阿坎德邦）的十七个 D. zeae 分离株进行了表征。UPGMA 聚类分析显示遗传异质性较高，遗传聚类在很大程度上与地理来源无关，表明印度 D. zeae 种群内存在广泛的遗传多样性。本研究开发了针对 recN 和 fliC 基因的特异性引物，分别扩增出 198 和 230 bp 的片段。fliC 引物对的检测灵敏度更高，可检测到低至 0.00001 ng μL^?1 的基因组 DNA，而 recN 引物对的检测限为 0.0001 ng μL^?1。两种引物对均能特异性地检测 D. zeae，且与非靶标细菌物种无交叉反应。使用 96 份田间玉米样本对 BIO-PCR 检测进行验证，结果显示 fliC 检测法在 100% 的症状样本和 15.38% 的无症状样本中检测出 D. zeae，优于 recN 检测法（分别为 96.77% 和 9.23%）。本研究首次全面评估了印度 D. zeae 种群的遗传多样性，并首次报道了基于 recN 和 fliC 基因的 BIO-PCR 检测方法，用于玉米中 D. zeae 的灵敏和特异检测。

引言

全球范围内，玉米（Zea mays L.）是第三大重要的谷物种，因其产量高、适应性强、作为食物、饲料和工业原料的广泛用途，以及对全球粮食和经济安全的重大贡献。它常被称为"谷物种后"，因为在谷物种中具有较高的遗传产量潜力。全球玉米产量约为 1217.9 Mt，种植面积约 139 Mha，平均产量接近 8.75 t/ha [1]。在印度，玉米产量为 38.085 Mt，种植面积约 10.744 Mha，平均单产约为 3.54 t/ha，使印度成为继美国、中国、巴西和阿根廷之后全球第五大玉米生产国 [1]。

全球范围内，玉米产量受到多种生物胁迫的严重限制。主要病害包括大斑病、小斑病、纹枯病、霜霉病、花后茎腐病和细菌茎腐病，这些病害在印度均造成显著的产量损失 [2]。由 Dickeya zeae（原命名为菊花欧氏菌玉米致病变种，Erwinia chrysanthemi pv. zeae）引起的细菌茎腐病（BSR）是全球玉米生产中最具破坏性的病害之一 [3,4]。这种具有重要经济影响的病害可使作物减产 21% 至 98.8%，分布于美洲、加拿大、印度和非洲，是热带和亚热带玉米产区面临的主要威胁 [3]。玉米茎腐病是一种从开花前到开花后阶段逐渐发展的复合病害，由多种真菌和细菌病原引起。

D. zeae 还可在多种单子叶和双子叶寄主（包括香蕉、水稻、玉米和马铃薯）中引起软腐病 [5,6]。该病害已在全球范围内有报道 [4,7,8,9,10]。此外，气候变化可能有利于 D. zeae 的出现和传播，对玉米生产构成重大威胁 [11]。在 Dickeya 属中，D. zeae 是独特的，因为它既可以侵染单子叶植物，也可以侵染双子叶植物，而其他物种通常只能侵染一种类型的植物 [12,13]。近年来，D. zeae 不仅给玉米，还给水稻和香蕉造成了巨大的经济损失，并报告了多个新的寄主关联 [5]。引起 BSR 的 D. zeae 主要侵染玉米的下部叶鞘和基部节间，使其变褐并软腐，导致突然萎蔫、倒伏并发出难闻气味 [8,14]。尽管在了解 D. zeae 侵染方面取得了重大进展，但在疾病流行病学、遗传多样性以及病原体的快速准确检测方面仍然存在挑战。

致病菌的基因型变异可通过基于重复 DNA 聚合酶链反应的指纹图谱（rep-PCR）来探索。这是一种快速、低成本且可靠的方法，已广泛用于评估亲缘关系密切的菌株间细菌病原体的遗传多样性，基于 PCR 扩增，使用特异性引物针对高度保守的重复元件，如 35–40 bp 的重复基因间回文（REP）序列、124–127 bp 的肠杆菌重复基因间共识（ERIC）和 154 bp 的 BOX 元件 [15,16]。

玉米茎腐病病原体的检测和鉴定通常采用形态学、培养学和分子生物学技术。相比之下，传统的细菌软腐病病原体鉴定方法耗时且需要专业知识。快速准确地鉴定玉米细菌茎腐病，并及时实施适当的防治措施，对于玉米生产成功至关重要。此前，针对感染不同寄主植物的 Dickeya 属细菌，开发了多种 PCR 检测方法，包括 pmrA、pelADE、pel 基因、pelY、pelI、cfa6、rhsA、recA 和 16S rDNA [17]。其中，Nassar 等人 [18] 描述的针对 pel 基因的 ADE1/ADE2 引物组已被广泛用于 Dickeya 属细菌的检测 [4,8,14,19,20]。然而，该引物组为属特异性，无法区分不同的 Dickeya 种。依赖 PCR 检测来检测细菌病原体存在一定的风险，特别是对于高度多变的果胶降解细菌病原体，如软腐肠杆菌 [21,22]。

为了克服这些局限性，人们设计了更精细的分子工具方法。例如，Karim 等人 [23] 利用比较基因组学分析，开发了六个针对 D. dianthicola 的特异性引物，其中两个的灵敏度足以在美国收集的 116 个样本中检测出 41 个含菌样本。此外，Silva 等人 [24] 设计了基于 recA 的引物，可特异性检测 E. psidii，利用常规 PCR、IC-PCR 和 BIO-PCR 技术实现番石榴病原菌的最优检测。Kabir 等人 [25] 使用种特异性引物开发了一种灵敏的种特异性 PCR 检测方法，用于检测 P. coryli、P. wasabiae、D. zeae 和 D. dadantii，而 Van Vaerenbergh 等人 [26] 针对 fliC 基因开发了引物和 TaqMan 探针，用于马铃薯中 D. solani 的特异性检测。

印度此前的研究主要集中在与玉米相关的 D. zeae 分离株鉴定上 [3,4]。依赖纯细菌培养限制了基于 PCR 的检测效率，因为 Dickeya 属细菌很难直接从感染植物组织中分离 [22]。然而，缺乏经田间验证的 D. zeae 特异性引物组以及缺少标准化的 BIO-PCR 方案，凸显了在印度开发和验证一种可靠的基于 PCR 的检测方法，用于从玉米植物组织中检测 D. zeae 的必要性。因此，本研究旨在调查印度 D. zeae 分离株的基因型多样性，并开发和验证一种针对 recN 和 fliC 基因的快速、灵敏和特异性 BIO-PCR 检测方法，用于直接从玉米植株样本中准确检测 D. zeae。

章节摘要

样本采集、细菌分离和致病性

2019 年至 2021 年间，从印度四个玉米种植邦（喜马偕尔邦、旁遮普邦、北阿坎德邦和特伦甘纳邦）的 17 个地理位置收集了感染细菌茎腐病的玉米样本（表 1）。将感染植物组织的小片段置于培养皿中的营养琼脂（NA）培养基上进行分离，并在 28 ± 1°C 下培养 4 天，方法如 Klement 等人 [27] 所述。典型细菌分离株在四十天大的玉米品种上进行了致病性测试。

症状学、致病性和病原体鉴定

田间条件下，细菌茎腐病症状逐渐发展，在所调查的各邦中发病率从 15.21% 到 37.93% 不等。初期症状包括下部叶片轻微萎蔫和叶缘黄化（图 1a），随后出现枯黄色叶片、叶片完全干枯和植株倒伏（图 1b 和 c）。病情加重后导致严重叶枯病、因基部茎秆削弱而倒伏（图 1d），以及近地面处出现水渍状病斑并进一步发展为

讨论

由 D. zeae 引起的细菌茎腐病已成为印度限制玉米生产日益重要的病害，这归因于玉米种植面积的扩大以及雨季期间温暖潮湿条件有利于病害发生 [2,4,34]。尽管印度多个玉米种植邦的 BSR 发生和分布已有记录 [4,33,35,36]，但关于其遗传多样性和种群结构的信息相对较少。

结论

总之，本研究揭示了印度 D. zeae 种群存在显著的遗传多样性，并确立了 Rep-PCR 指纹图谱作为独立于农业气候来源的种群区分的快速可靠方法的价值。fliC 和 recN 基于 BIO-PCR 检测方案的验证进一步提供了灵敏和特异性的分子工具，用于从有症状和无症状的玉米植株中早期检测 D. zeae，其中基于 fliC 的检测方案表现出

CRediT 作者贡献声明

Rajender Jatoth：论文写作——审阅与编辑、论文写作——初稿、可视化、验证、方法学、调查研究、概念构思。P. Lokesh Babu：论文写作——审阅与编辑、论文写作——初稿、可视化、验证、软件。Neelam Geat：方法学、调查研究、形式分析。G.S. Madhu：论文写作——审阅与编辑、论文写作——初稿。Dinesh Singh：可视化、资源、项目管理、资金获取、形式分析。

伦理标准

本文不包含任何作者使用动物进行的实验研究。

资助

不适用。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文所报道工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

作者非常感谢印度农业研究理事会-印度农业研究所（ICAR-IARI）新德里植物病理学部门负责人，在整个调查过程中提供的经济支持和帮助。

Rajender Jatoth | P. Lokesh Babu | Neelam Geat | G.S. Madhu | Dinesh Singh

印度农业研究理事会-印度农业研究所（ICAR-IARI）植物病理学分部，新德里，印度