《Physiological and Molecular Plant Pathology》：Transcriptomic analysis reveals potential mechanisms involved in the infection process of blueberry anthracnose pathogen
Colletotrichum fioriniae
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摘要蓝莓炭疽果腐病由Colletotrichum属引起，是一种毁灭性的采后腐病，威胁着生产系统。虽然蓝莓对感染的防御反应已被研究，但对病原体生物学的表征主要局限于显微观察。本研究评估了Colletotrichum fioriniae感染感病栽培品种'Jersey'蓝莓果实过程
摘要
蓝莓炭疽果腐病由Colletotrichum属引起，是一种毁灭性的采后腐病，威胁着生产系统。虽然蓝莓对感染的防御反应已被研究，但对病原体生物学的表征主要局限于显微观察。本研究评估了Colletotrichum fioriniae感染感病栽培品种'Jersey'蓝莓果实过程中的感染过程。用C. fioriniae分生孢子悬浮液接种果实。分别在接种后1、12、24、48、72、96、120和168小时以及接种后14天提取RNA并进行测序。将测序 reads 比对到C. fioriniae参考基因组，并进行从头转录组组装以鉴定新转录本，随后进行注释。对不同表达基因（DEGs）的分析揭示了表达趋势，重点关注与致病过程相关的基因。该分析发现表达的主要转变发生在接种后12小时、24至72小时之间、接种后96小时、120小时以及14天，为先前表征的感染阶段提供了分子背景。对碳水化合物活性酶（CAZymes）表达模式的考察显示，植物细胞壁降解酶（PCWDEs）从48到96小时显著上调。对DEGs的考察发现，在96和120小时分别与多聚酮类化合物aurofusarin和depudecin的生产相关的大量转录活性，提示了这些多聚酮类化合物在感染过程中先前未被报道的作用。我们的研究在分子水平上扩展了对蓝莓-C. fioriniae相互作用的理解，并验证了先前对病害系统的显微表征。
引言
高丛蓝莓是一种木本结果多年生作物，具有广泛的全球产业[1]。由Alternaria、Botrytis和Colletotrichum属引起的采后果腐是蓝莓生产面临的最严重威胁之一[2]。蓝莓炭疽果腐主要由C. fioriniae（C. acutatum种复合群）和C. gloeosporioides复合群的成员引起[3]。Colletotrichum物种的感染具有静止特性，主要在季节后期出现，炭疽病的症状通常直到收获或采后才出现。病原体C. fioriniae可以轻易侵染邻近果实，有可能导致产品完全损失[4]。虽然蓝莓炭疽病害系统已被广泛研究，但大多数焦点集中在宿主抗性的性质上，对病原体的分子研究很少。此外，许多研究在C. fioriniae被明确划分为独立物种之前是以C. acutatum的名义发表的。由于文献中不清楚指的是C. acutatum物种还是复合群中的成员如C. fioriniae，这增加了病原体研究的复杂性。
C. fioriniae在蓝莓上的主要感染过程始于开花期，此时分生孢子从前一年感染的花芽鳞片上飞溅分散到花组织上。分生孢子萌发并发育出附着胞，附着胞迅速积累黑色素[5]。感染在果实发育过程中保持静止，直到果实成熟，此时病原体根据宿主抗性采取不同的感染策略[6]。由于静止特性和频繁的二次感染，对感染过程的研究主要表征了分生孢子直接感染果实的过程。在与'Jersey'等品种的易感相互作用中，C. fioriniae采取细胞内半生物营养型感染方式。接种后约12小时，分生孢子已萌发并形成黑色素化的附着胞。到48小时，附着胞已突破表皮细胞壁，真菌在宿主内形成细胞内感染泡。粗大的初生菌丝从感染泡生长到邻近细胞。在这一过程中，果实产生H2O2增加，但比耐受性相互作用中小得多[7]。到96小时，粗大的初生菌丝产生在细胞间生长的次生菌丝，并采取坏死营养型感染的特征，表现为广泛的宿主定殖和宿主细胞死亡。打结的菌丝聚集体，将最终产生分生孢子盘，从这时开始发育。到120小时，在感病品种'Jersey'上，分生孢子盘已突破果实角质层并可见于果实表面[6]。这些分生孢子盘产生大量分生孢子，可导致进一步的感染事件，特别是在邻近果实上。
在与'Elliott'等品种的炭疽病耐受性感染相互作用中，附着胞的黑色素化率较低。病原体不突破表皮细胞壁，而是采取角质层下细胞间坏死营养型方式，即在角质层下方和植物细胞之间生长。到48小时，果实产生H2O2快速诱导[7]，没有明显的细胞内感染。到96小时，出现过敏反应并花青素水平增加，尝试的细胞内感染受到限制并被未表征的非定形酚类沉积物包围[6]。角质层下菌丝的细胞质变得颗粒化和无序，表明功能障碍。分生孢子盘形成较少且较晚，约在156小时。与易感相互作用相比，分生孢子盘直径较小且分生孢子较少[6,7]。
蓝莓果实的防御反应已有更彻底的分子表征。例如，耐受性'Elliott'蓝莓在被C. fioriniae感染时上调了几个防御相关基因。其中一些基因最终在感病宿主'Jersey'中也被上调，但在较晚的时间点。金属硫蛋白类似蛋白编码基因和II类几丁质酶基因即属此类[7]。这表明在感病宿主中病原体逃逸宿主防御的能力比在耐受性宿主中更强。最近的工作确定了与蓝莓炭疽病抗性相关的三个位点：一个与细胞因子信号蛋白同源物的调控相关，一个与预测与病原体防御调控因子如苯丙氨酸解氨酶（PAL）相互作用的Yab5同源物相关，以及一个预测在花青素代谢中发挥作用的SGNH水解酶型酯酶家族蛋白同源物[8]。这些数据补充了先前的发现，即槲皮素3-O-鼠李糖苷和丁香树脂素鼠李糖苷被证明对C. fioriniae具有抗真菌效果[9]。
其他Colletotrichum病害系统已被彻底研究。附着胞的黑色素化已被证明是C. fructicola感染苹果所必需的[10]，但对C. gloeosporioides感染杨树则不是必需的[11]。对C. fioriniae和其他引起苹果苦腐病的Colletotrichum物种的基因组分析揭示了庞大的潜在效应子库、碳水化合物活性酶（CAZymes）和可能有致病作用的生物合成基因簇[12]。然而，不清楚在感染过程中何时表达哪些基因。对感染高粱的C. sublinolea基因表达数据的分析揭示了CAZyme和效应子分泌的模式，两种CAZymes和分泌效应子的最大表达均发生在接种后第三天，即从生物营养型向坏死营养型感染的转变期间[13]。应用类似的方法考察C. fioriniae-蓝莓病害系统将使我们了解不同物种如何利用其各自的效应子和CAZymes库进行感染。
理解宿主抗性的分子机制至关重要，但了解病原体自身利用的机制也很有价值[14]。为此，本研究使用转录组分析表征了炭疽病易感品种'Jersey'的感染过程，重点关注植物细胞壁降解酶、效应子、毒力因子以及不同感染阶段的转录变化。通过将每个时间点与前一个时间点进行比较，我们获得了对不同感染阶段之间转变的见解。我们观察到在1、12、48、96和120小时关键疾病发展阶段的基因表达聚类。具体而言，我们观察到12小时与黑色素化相关基因的上调，以及48到96小时植物细胞壁降解酶（PCWDEs）的广泛上调。我们还在96和120小时观察到多聚酮类生物合成基因簇的上调，分别对应于多聚酮类化合物aurofusarin和depudecin。
章节摘要
确认C. acutatum 143A的身份
本实验设计基于Wharton和Schilder先前关于C. acutatum 143A分离物在蓝莓果实上感染过程研究中定义的时间点[6]。143A分离物从长期储存的土豆葡萄糖琼脂（PDA）中复苏。生长7天后，使用Quick-DNA Fungal/Bacterial Miniprep Kit（Zymo Research, Irvine, CA, U.S.A.）提取DNA。通过PCR扩增六个位点（ITS/540 bp, GAPDH/254 bp, CHS1/282 bp, HIS3/386 bp, ACT/245 bp, TUB2/491 bp）用于
C. acutatum 143a是C. fioriniae
先前关于蓝莓炭疽果腐病的研究是使用C. acutatum分离物进行的，其中一部分此后被重新指定为C. fioriniae。为了验证先前使用C. acutatum 143A分离物的工作在新的分类下应被视为C. fioriniae，对六个位点（ITS, CHS1, ACT, TUB2, HIS3, GAPDH）进行了Sanger测序。串联的六位点序列与其他用于系统发育研究的C. fioriniae分离物具有100%序列一致性
讨论
C. fioriniae在蓝莓上的感染过程已通过显微观察得到充分表征，但据我们所知，尚未对病原体感染过程的分子表征进行研究。此外，先前的表征是在C. fioriniae从C. acutatum种复合群中明确划分之前进行的，这使得先前工作中使用的真菌身份不明确。本研究明确了Wharton和Schilder[6]中使用的143a分离物的身份为C. fioriniae，
作者贡献声明
Shay L. Szymanski: 撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，软件，资源，方法论，形式分析，数据整理，概念化。Jaynee Hart: 撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，可视化，方法论，形式分析。Timothy D. Miles: 撰写——审阅与编辑，监督，资源，项目管理，方法论，资金获取，数据整理，概念化。
资金支持
本工作由美国农业部特色作物研究计划（MICL20054）资助。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文报告工作的竞争性经济利益或个人关系。
致谢
我们要感谢Marivi Colle博士在RNA提取过程中做出的宝贵贡献，以及密歇根州立大学研究和技术支持设施基因组学核心组的RNA测序服务。作者感谢允许我们采样其田地的密歇根蓝莓种植者。作者还感谢Martin Chilvers博士、Alejandro Rojas博士和Gregory Bonito博士审阅本文。此外，我们
Shay L. Szymanski|Jaynee Hart|Timothy D. Miles
密歇根州立大学植物、土壤与微生物科学系，1066 Bogue St, East Lansing, MI, 48824, USA
