大叶柴胡中与胞外糖聚体诱导免疫反应相关的候选LysM受体相关蛋白的鉴定与表征

《Physiological and Molecular Plant Pathology》：Characterization of candidate LysM receptor-related proteins associated with extracellular glycan-induced immune responses in Atractylodes macrocephala

　　

摘要

白术（大叶白术）是一种药用植物，极易受到齐整小核菌（齐整小核菌）引起的根腐病侵害。据报道，齐整小核菌细胞壁来源的多糖（SR）可作为白术免疫反应的诱导子；然而，与SR诱导免疫反应相关的上游分子组分仍知之甚少。在本研究中，我们鉴定了三个响应SR处理的候选LysM受体基因——AmLYK4、AmLYK5和AmCEBiP——并对其进行了功能表征。序列与结构域分析表明，AmLYK4和AmLYK5编码LysM受体样激酶，而AmCEBiP编码一种缺乏胞内激酶结构域的LysM受体样蛋白。SR处理可导致AmLYK4、AmLYK5和AmCEBiP转录本的快速且瞬时诱导。双分子荧光互补（BIFC）实验在本氏烟中表明，在检测条件下三种候选蛋白可出现在相近的空间位置，且在SR处理后观察到更强的荧光信号；然而，这一差异并不能证明复合物形成增强。在白术叶片中，各候选基因的瞬时过表达均伴随SR诱导的防御相关基因表达增强，而病毒诱导的基因沉默则减弱了这些反应。综上所述，这些发现表明AmLYK4、AmLYK5和AmCEBiP与SR诱导的免疫反应相关，可能参与白术中的糖类响应防御调控。这些候选蛋白与SR多糖之间的直接结合仍有待确立。

引言

大叶白术是菊科术属的一种草本植物。该植物为中国特有种，种植于浙江、湖南、江西、安徽和福建等多个省份的200多个乡镇（Yang等，2023）。由于过度采挖和栖息地持续退化，野生种群数量急剧减少，在许多地区已濒临灭绝、处于受威胁状态或已区域性绝迹（Yang等，2023）。相比之下，大叶白术作为一种药用作物被广泛种植，估计种植面积约为2000公顷，年根茎产量约为7000吨（Peng等，2011）。其干燥根茎在中药中被称为"白术"，长期以来被用于治疗食欲不振和腹胀等多种病症（Zhu等，2018）。然而，大叶白术经常受到土传病原菌引起的根腐病侵害，这仍然是制约其栽培的主要因素（Fan等，2024）。因此，根茎产量可能大幅降低，在严重发病的田块中损失可达约60%（Zhu等，2025）。因此，提高抗病性是大叶白术可持续生产的关键优先事项。

齐整小核菌是一种破坏性土传真菌，可引起多种双子叶植物和单子叶植物寄主的根部及茎基部腐烂（Karat等，1985），被认为是大叶白术根腐病的主要致病因子（Zhou等，2016；Wu等，2023）。在齐整小核菌属和核盘菌属等嗜腐生真菌中，致病性在很大程度上归因于降解细胞壁的酶，这些酶瓦解寄主细胞壁，以及分泌的效应子抑制或逃避免疫识别（Liang和Rollins，2018）。相比之下，真菌细胞壁组分在侵染过程中的作用仍相对不太清楚。值得注意的是，齐整小核菌细胞壁来源的糖类已被证明可激活大叶白术的免疫反应（Zheng等，2018）。与此同时，从菊属植物中分离的植物来源糖类可增强大叶白术对齐整小核菌的抗性，至少部分是通过促进防御性次生代谢物积累（Zhou等，2016）和激活受体介导的防御反应（Chen等，2025）来实现的。尽管取得了这些进展，大叶白术中感知齐整小核菌细胞壁糖类并启动免疫反应的模式识别受体（PRRs）仍知之甚少。

为抵御病原物侵入，植物主要依赖细胞表面的PRRs来检测病原物和微生物相关分子模式（PAMPs和MAMPs），这些信号共同驱动植物免疫反应的激活（Tripathi等，2024）。除了即时防御激活外，诱导抗性和免疫启动——包括可延续至下一代的影响——也有助于植物在病原物压力下的适应性。诱导子是病原物释放或产生的结构多样化分子，包括寡糖、肽类、脂质和蛋白质（D'Ovidio等，2004；Boller，1995）。这些信号连同植物来源的内源性配体（损伤相关分子模式，DAMPs）被植物细胞表面的PRRs感知，从而激活下游免疫信号通路。在已知的诱导子类别中，糖类如聚半乳糖醛酸寡糖、β-葡聚糖、几丁质或壳聚糖寡糖，以及其他糖类，已成为植物免疫的重要触发因子（Meresa等，2024；Molina等，2024）。然而，确定相应的受体并阐明配体感知转化为免疫激活的机制仍是一项重大挑战。迄今为止，仅有限数量的受体被确立为特定诱导子的确证受体，大部分工作集中在含LysM的结构域的模式识别受体上（包括受体样激酶和受体样蛋白），以及最近对受体样激酶（RLK）超家族中其他成员的研究，如LRR-MAL受体激酶和携带麦芽糖结合样结构域的CrRLK1Ls（Molina等，2024）。在这一框架下，植物LysM蛋白作为糖类结合模块发挥模式识别受体的功能，通过感知几丁质并激活免疫反应，在寄主-病原物相互作用中发挥关键作用（Hu等，2021）。LysM结构域存在于含LysM的受体样激酶（LYKs）和非激酶型LysM受体样蛋白中，该家族高度多样化，反映了LysM模块被纳入广泛的结构域架构（Zhang等，2007、2009）。在水稻中，几丁质诱导子结合蛋白（CEBiPs）是最早被鉴定的植物LysM受体样蛋白（RLPs）（Kaku等，2006）。此外，OsLYP4和OsLYP6同样为LysM RLPs，可结合几丁质，能形成同源和异源二聚体，与CEBiP互作，并参与肽聚糖和几丁质触发的信号转导（Liu等，2013）。然而，除水稻和拟南芥等模式物种外，关于药用植物大叶白术中糖类诱导免疫的受体类型、结构特征和互作模式知之甚少。

我们此前的研究表明，菊多糖（CIPs，来自菊的多糖）可提高防御相关基因（包括HMGR、DXR、CHI和LOX）的表达，并增强大叶白术对齐整小核菌的抗性（Xiong等，2021）。随后的筛选鉴定出两个LysM受体样激酶AmCERK1和AmLYK3，它们在内质网膜互作并参与大叶白术中CIP诱导的防御反应（Chen等，2025）。同时，从齐整小核菌细胞壁中提取的多糖（SR）已被报道作为真菌诱导子，可诱导防御反应和对南方疫病（南疫病）的 systemically acquired resistance，伴随广泛的转录重编程（Zhang等，2017；Wu等，2023）。鉴于SR多糖来源于真菌细胞壁，它们被提议作为PAMPs，激活大叶白术中的防御相关基因并触发先天免疫反应。此外，我们最近的研究证明，来自SR的胞外半乳甘露聚糖变化与大叶白术防御反应的变化相关（Long等，2026）。尽管SR能够诱导大叶白术的防御反应，但与这些反应相关的上游组分仍知之甚少。因此，鉴定响应SR的候选LysM受体基因并评估其对SR诱导免疫的潜在贡献，对于理解该物种中的糖类响应信号转导具有重要意义。

我们采用BiFC、瞬时过表达和VIGS技术，考察AmLYK4、AmLYK5和AmCEBiP的空间关联，并评估这些候选基因表达改变是否影响SR诱导的防御反应。本研究并非旨在建立这些蛋白与SR多糖之间的直接结合关系。

章节片段

大叶白术中三个候选LysM受体基因的鉴定与序列分析

本研究考察的候选基因选自先前在大叶白术转录组中鉴定的LysM-RLK/RLP家族。在我们早期的工作中，使用来自拟南芥和水稻的LysM-RLK/RLP序列作为查询，通过BLAST+搜索对大叶白术转录组进行比对。候选转录本随后通过开放阅读框（ORF）预测、基于HMMER的LysM结构域验证（Eddy，2011）、冗余序列去除和功能

信号肽、保守结构域和跨膜区域

信号肽、结构域和拓扑结构预测揭示了AmLYK4、AmLYK5和AmCEBiP在结构特征上的差异（图1）。SignalP 4.1在三种蛋白中均鉴定出N端信号肽，分别跨越AmLYK4的第1-23个残基、AmLYK5的第1-20个残基和AmCEBiP的第1-22个残基，提示存在N端信号肽。对预测的AmLYK4、AmLYK5和AmCEBiP序列进行ProSite分析表明，AmLYK4和AmLYK5各含有两个经典的约40个氨基酸的LysM模

讨论

理解植物-病原物相互作用的分子基础长期以来一直是植物免疫研究的中心课题。在本研究中，我们使用SR作为真菌糖类诱导子，研究大叶白术中与免疫反应相关的候选LysM受体蛋白。信号肽、保守结构域和跨膜区域分析支持将AmLYK4和AmLYK5归类为候选LysM受体样激酶，AmCEBiP归类为候选LysM受体样蛋白。

CRediT作者贡献声明

田伟：撰写–审阅与编辑、监督、概念设计。吴坤：撰写–审阅与编辑、软件、形式化分析、数据管理、概念设计。龙泽宇：撰写–原稿撰写、软件、形式化分析、数据管理、概念设计。罗国福：撰写–审阅与编辑、软件、形式化分析、数据管理、概念设计。陈雷：撰写–审阅与编辑、概念设计

未引用参考文献

Takahashi等，2013；Zhu等，2025。

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

竞争性利益声明

? 作者声明不存在任何已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文所报道的研究工作。

致谢

感谢浙江大学农林大学食品与健康学院在研究过程中提供的协助和支持。作者声明不存在任何已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文所报道的研究工作。仅使用基于AI的工具提供了语言编辑辅助，所有科学内容、数据解读和结论均由作者生成和验证。

龙泽宇|陈雷|罗国福|吴坤|田伟

浙江大学农林大学食品与健康学院，杭州，中国