甘氨酸和水杨酸通过上调蛹虫草中生物合成基因 Cns3 协同促进虫草素和脱氧胞苷嘧啶核苷的合成

《Process Biochemistry》：Glycine and Salicylic Acid Synergistically Promote Cordycepin and Pentostatin Synthesis by Up-regulating the Biosynthetic Gene Cns3 in Cordyceps militaris

　　

摘要

本研究旨在探讨甘氨酸（Gly）和水杨酸（SA）对蛹虫草（Cordyceps militaris）深部发酵过程中两种关键生物活性代谢物——虫草素和培他达星的生成的影响。在各自最佳浓度下单独添加时，Gly和SA均显著提高了这些代谢物的产量，而两者联合添加则使代谢物积累量进一步增加。鉴于虫草素和培他达星通过Cns3依赖途径合成，我们假设Gly和SA可能影响Cns3基因的表达。RT-qPCR分析证实，联合处理上调了Cns3的转录水平。这些结果表明，Gly和SA作为有效诱导剂，通过激活Cns3同时促进虫草素和培他达星的生物合成，并为提高C. militaris的发酵效率提供了实用策略。

引言

蛹虫草（Cordyceps militaris）是一种著名的药食两用真菌，具有丰富的药理和营养价值[1], [2]，能够产生多种具有重要药理学意义的次生代谢产物，包括虫草素（3'-脱氧腺苷，COR）和培他达星（脱氧协霉素，PTN）。这些化合物具有广泛的生物活性，包括抗肿瘤、免疫调节和抗炎作用，使其在药物开发和功能性食品应用中具有重要价值[3], [4]。近期研究表明，C. militaris中COR和PTN的生物合成紧密耦合，并受同一基因簇（Cns1-Cns3）调控。具体而言，前体腺苷首先被Cns3蛋白的核苷激酶（NK）结构域磷酸化为3'-腺苷单磷酸（3'-AMP）。随后，由Cns2形成的蛋白复合物将3'-AMP转化为中间体2'-羰基-3'-脱氧腺苷（2'-C-3'-dA）。最终，Cns1催化2'-C-3'-dA的还原生成虫草素。与此同时，Cns3蛋白的HisG结构域负责培他达星的生物合成，该物质作为保护分子，抑制COR的快速脱氨和降解，从而稳定其在细胞内的积累[5]。

为提高这些代谢物的产量，大量研究聚焦于培养基优化及添加能够调节代谢通量的外源添加剂[6]。例如，富含脂质的基质或直接添加脂肪酸可显著增强COR的积累并提高Cns1和Cns2等生物合成基因的转录水平[7]。同样，使用替代氮源（如玉米浆水解物）或补充特定氨基酸已被报道可通过影响细胞营养平衡和基因调控来提高COR产量[8], [9]。近期，基于机器学习的data-driven方法也被探索用于预测不同培养条件下的虫草素产量，为提高工艺优化和发酵效率提供了有前景的策略[10]。这些发现表明，外源添加剂可通过营养供给、胁迫信号传导或Cns基因簇的转录调控来改变次生代谢。与COR相比，通过培养基添加剂提高PTN产量的研究仍较为有限。然而，近期研究已阐明了PTN的生物合成途径及其遗传基础，确认其与COR产量存在强耦合关系[11]。鉴于COR和PTN共享生物合成步骤和调控机制，调控Cns基因簇——尤其是关键酶Cns3——的策略可能同时影响两种代谢物的合成。Cns3是Cns1-Cns4簇中编码的核心酶之一，在共享生物合成中间体的形成中发挥关键作用，并参与COR和PTN生物合成的调控[12]。先前的研究表明，在特定营养条件或氨基酸补充下，Cns2和Cns3表达水平的变化与COR积累的改变相关[9]。然而，外源添加剂是否通过调节Cns3转录本丰度来增强代谢物产量仍有待明确。

基于上述发现，本研究旨在筛选一系列外源添加剂，鉴定出能在C. militaris深部发酵过程中同时提高COR和PTN产量的添加剂。此外，为阐明其潜在机制，我们探究了所选添加剂是否影响Cns3基因的表达水平。本工作为理解C. militaris次生代谢的调控生物学提供了新的见解，并为其两种主要药用代谢物共生产的提高提供了实用策略。

章节片段

化学试剂与材料

蔗糖、葡萄糖和硫酸镁购自上海麦克林生化科技有限公司（中国）。蛋白胨和牛肉浸粉购自北京澳博星生物科技有限公司（中国）。磷酸二氢钾购自天津登克化学试剂有限公司（中国）。琼脂购自国药化学试剂有限公司（中国）。COR购自上海源叶生物技术有限公司（中国），而甲醇和乙酸铵购自

模型预测与最佳培养基配方

如图1a所示，采用Matern32核函数的GPR模型获得了最佳预测性能。Y?（COR）模型的R2和RMSE值分别为0.9390和38.07，而Y?（PTN）模型的相应值分别为0.9913和1.82，表明模型拟合精度极高。预测值与观测值的散点图显示沿1:1线呈高度一致性，狭窄的95%置信区间表明模型具有较高的稳定性和可靠性。基于联合响应优化（

Gly和SA协同调控Cns3的分子机制

本研究证明，外源Gly和SA分别能提高C. militaris中COR和PTN的产量，且两者联合应用产生显著协同效应，伴随Cns3的上调，暗示了一种互补机制：Gly通过提供关键的碳-氮骨架直接参与从头嘌呤生物合成[28]，从而增加COR前体的供应；而SA则作为化学诱导剂激活胁迫响应

结论

总之，本研究证明Gly和SA是高度有效的诱导剂，能同时促进蛹虫草深部发酵过程中COR和PTN的生物合成。在各自最佳浓度下单独添加时，Gly和SA均显著促进了代谢物的产量，而两者联合添加则驱动了这两种生物活性成分的协同积累。在机制上，qRT-qPCR分析证实了Gly和SA的组合

资助

本工作得到了山东中医药大学2024年科学研究基金项目（KYZK2024Z05）和科技中小企业创新能力提升项目（2022TSGC2456）的支持。

CRediT作者贡献声明

韩春超：写作——审阅与编辑，写作——原稿撰写，监督，资源获取，项目管理，方法学，资金获取。王先磊：写作——原稿撰写，软件，资源获取，方法学，调查研究，资金获取，数据整理。李岩：写作——审阅与编辑，写作——原稿撰写，软件，方法学，形式分析，数据整理，概念构思。杨梦圆：写作——审阅与编辑，写作——原稿撰写，可视化，

利益冲突声明

作者声明，他们不存在可能影响本文报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

利益冲突声明

作者声明，本研究是在不存在任何可被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

杨梦圆|李岩|王先磊|韩春超

山东中医药大学药学院，山东济南，250355，中国