《Process Biochemistry》：Scalable production and freeze-drying of
Cordyceps militaris double nanoemulsion powder: Enhanced bioactivity and long-term stability
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摘要蛹虫草（CMs）是一种寄生于昆虫幼虫的高价值药用真菌，富含生物活性腺苷（ADE）和虫草素（COR）。然而，两者较差的稳定性和生物利用度限制了其实际应用。本研究开发了一种可规模化的双纳米乳液（W1/O/W2）包封CMs提取物的工艺，随后采用麦芽糊精-海藻糖载体将其转化为冷冻
摘要
蛹虫草（CMs）是一种寄生于昆虫幼虫的高价值药用真菌，富含生物活性腺苷（ADE）和虫草素（COR）。然而，两者较差的稳定性和生物利用度限制了其实际应用。本研究开发了一种可规模化的双纳米乳液（W1/O/W2）包封CMs提取物的工艺，随后采用麦芽糊精-海藻糖载体将其转化为冷冻干燥粉末。生产成功扩大至4公斤批次。该体系平均液滴粒径维持在121.7±5.7 nm，具有可接受的多分散性指数和Zeta电位值。通过XRD、TGA和电子显微镜表征，确认了其非晶态结构和较高的热稳定性。在12个月的储存期内，ADE和COR的保留率均保持在90%以上，遵循一级动力学，且水分和分散性仅有轻微变化。此外，该纳米制剂不仅维持了CMs提取物的抗氧化活性，而且与粗提物相比，对大肠杆菌（E. coli）和金黄色葡萄杆菌（S. aureus）表现出更强的抗菌活性。这一集成化工艺流程证实了CMs双纳米乳液粉末在功能性食品和营养补充剂应用中的工业潜力。
引言
近年来，蛹虫草（CMs）因其富含虫草素（COR）、腺苷（ADE）和多酚等生物活性化合物而备受关注，这些化合物具有广泛的生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗菌和免疫调节作用[1]、[2]、[3]。然而，这些生物活性物质的工业应用面临重大障碍。ADE和COR以游离形式存在时稳定性有限，容易被腺苷脱氨酶降解，且对pH值和氧化性物质等环境因素高度敏感，导致口服生物利用度较差[4]、[5]。事实上，ADE和COR与许多其他不稳定的生物活性物质类似，在暴露于光线、热量、氧气或胃肠道酶时极易发生快速降解。这种固有的脆弱性通常会导致其在加工和储存过程中生理效价显著损失，从而限制了其在实际应用中的有效性。这些局限性凸显了对能够有效保护和增强这些敏感化合物吸收的递送系统的迫切需求[6]、[7]。
为克服这些缺陷并保护此类精密成分，各种包封和纳米制剂策略已被开发，包括固体脂质纳米粒[8]、纳米结构脂质载体[9]、[10]、[11]、脂质体[12]和纳米乳液[13]、[14]、[15]。其中，纳米乳液被认为是有前景的功能性食品应用平台，因其能够提高稳定性、增加界面表面积并保护生物活性物质免受降解。在我们先前的研究中，我们成功研究了从CMs中提取ADE和COR的最佳条件，以最大限度地提高其回收率[16]。随后，这些化合物被包封进纳米脂质体系统以提高其稳定性和控释性[17]、[18]、[19]。此外，我们成功确定了双纳米乳液（W1/O/W2）系统在实验室规模下的最佳配方和加工参数[20]。
特别是，双乳液（W1/O/W2）为包封ADE和COR等亲水性但不稳定的化合物提供了优越的结构架构[21]。通过提供多室屏障，该系统不仅有利于控释和提高生物利用度，而且在工业配方中还提供了一个独特的优势——掩盖不愉快的味道，并防止活性核心与外部环境直接接触[22]、[23]、[24]。
在配方组分中，油相的选择是影响W1/O/W2双乳液形成、包封性能和稳定性的最关键因素之一。选择葵花籽油作为油相是基于我们先前的系统筛选研究，该研究为本研究中考察的规模化过程提供了配方依据[20]。在那项研究中，十二种食品级植物油被评估用于制备含有ADE和COR的W1/O/W2双纳米乳液。富含不饱和脂肪酸的油类（包括葵花籽油）通常比含有较高比例饱和脂肪酸的油类（如椰子油和棕榈油）对ADE和COR具有更高的包封效率。因此，选择葵花籽油用于后续配方开发，原因是其包封性能良好、液态、粘度较低、界面张力低、与PGPR相容性好，且作为常用食品级原料，被认为是安全的并在市场上广泛供应[13]、[25]。这些特性有助于PGPR在整个连续油相中均匀分布，并在第二步乳化前支持初级W1/O乳液的形成。
尽管W1/O/W2系统具有明显的优势，但大多数现有研究仍局限于实验室规模生产，未能充分解决与规模化相关的关键挑战，如能量分布不均匀、流动动力学改变以及大批量加工过程中相分离的风险[26]。大多数研究尚未探讨如何在双乳液规模化中维持动力学相似性和超声乳化中的能量耗散密度[27]。此外，虽然液态纳米乳液具有较高的生物活性，但其易受长期物理不稳定性（如聚结和Ostwald熟化）的影响，需要转化为固态粉末以确保商业货架寿命和实际适用性[28]。
在将分散体系转化为粉末制剂时，喷雾干燥和冷冻干燥都被广泛应用于乳化基递送系统的生产[29]。喷雾干燥因其高产量和相对较低的加工成本而在工业生产中颇具吸引力。然而，干燥过程中涉及的高温可能对热敏感生物活性化合物产生不利影响，在某些加工条件下也可能加速油相中不饱和脂质的氧化[29]。本研究选择冷冻干燥，是因为CMs提取物中两种主要生物活性化合物ADE和COR对热处理敏感，而葵花籽油相中含有易被氧化的不饱和脂肪酸。当与合适的冻干保护剂（如麦芽糊精和海藻糖）结合使用时，冷冻干燥可以生成非晶态保护基质，有助于保持双纳米乳液系统的结构完整性[30]、[31]。然而，本研究未对冷冻干燥和喷雾干燥进行直接的实验比较。这代表了当前工作的一项局限，因此不能从现有结果中得出任何一种干燥方法优越性的结论。相反，本研究专门针对规模化双纳米乳液系统的冷冻干燥工艺开发和优化。在匹配的工况条件下与喷雾干燥进行直接比较（包括产品质量、包封效率、生物活性保留率、氧化稳定性、能耗、加工时间和粉末回收率）已计划作为未来工作，以确定最合适的工业化干燥策略。
基于上述考虑，本研究旨在开发一种涵盖配方设计、扩大至4公斤/批次的中试规模以及冷冻干燥的集成工艺，用于负载CMs提取物的W1/O/W2系统。基于已优化的实验室规模工艺[20]，本研究探讨了关键工艺参数的维持，以弥合台式研究与工业生产之间的差距。该研究全面评估了理化性质、长达12个月的长期稳定性及生物活性，为开发稳定的、高效天然基功能性食品和药品铺平了道路。
章节片段
化学物质和仪器
蛹虫草（Cordyceps militaris）样品购自越南同塔省永利社天安蛹虫草有限公司。葵花籽油购自胡志明市当地超市。乳化剂包括聚甘油蓖麻醇酸酯（PGPR）和吐温80，由海航（中国）供应。氯化钙（CaCl2）由西陇（中国）供应。麦芽糊精（DE 15-20）购自丰辰（中国），海藻糖购自Treha（日本）。
本研究中使用的主要仪器如下：
结果与讨论
该工作流程包括四个主要阶段：（1）通过将CMs提取物与CaCl2、油相和PGPR乳化剂进行均质化形成初级乳液，（2）通过与含吐温80的外水相进行二次均质化制备NCMs，（3）超声辅助处理以减小液滴尺寸并增强乳液均匀性和稳定性，（4）对优化后的纳米乳液进行冷冻干燥以获得NCM粉末，随后进行理化表征，包括颗粒
结论
本研究成功建立了一套可规模化的制备蛹虫草负载双纳米乳液的方案，从实验室配方到4公斤中试批次，未损害其理化完整性。放大后的纳米乳液保持了纳米级液滴粒径、高Zeta电位以及腺苷和虫草素均超过90%的包封率（EE）。此外，通过采用麦芽糊精-海藻糖基质（3:1比例）对液态体系进行冷冻干燥固化为
CRediT作者贡献声明
Nguyen Thanh Tan：调查研究、数据整理、形式化分析、验证、方法论、软件、撰写——初稿。Nguyen Ba Thanh：调查研究、数据整理、形式化分析、验证、方法论、软件、撰写——初稿。Tran Quang Hieu：概念化、数据整理、方法论、软件、可视化、撰写——审阅与编辑。Phan Minh Vuong：数据整理、形式化分析、验证。Pham Quynh Nhu：数据整理、形式化分析、验证。Nguyen Thi
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。
Nguyen Thanh Tan|Nguyen Ba Thanh|Tran Quang Hieu|Phan Minh Vuong|Pham Quynh Nhu|Nguyen Thi Hong No|Nguyen Phuong Tuyen|Le Van Dung
胡志明市工业大学生物技术与食品技术研究所，胡志明市和平郡阮文包街12号，700000，越南
