黑球酵母共利用甘蔗糖蜜与菊芋在聚氨酯基质中低成本高效生产聚(β-L-苹果酸)

《Process Biochemistry》：Low-cost and high-efficiency production of poly(β-L-malic acid) by Aureobasidium melanogenum via co-utilization of Cane molasses and Jerusalem artichoke in polyurethane matrices

　　

摘要：

β-聚 (L-苹果酸) (PMLA) 是一种可生物降解的聚酯，因其在中医学及相关领域的有前景应用而具有工业价值。利用可再生原料生产 PMLA 已成为一种有利的策略，其中菊芋块茎 (JA) 和糖蜜——丰富的非谷物资源——尤为引人注目。本研究创新性地开发了一种由黑耳丝壳菌实现的具有成本效益的聚 (β-L-苹果酸) (PMLA) 生产系统，结合了聚氨酯基质 (PUM) 固定化和甘蔗糖蜜与菊芋水解液 (JAH) 的共同利用。筛选出的原始 60 ppi PU 作为最佳载体（277% 的固定化容量），以增强微生物粘附和 PMLA 合成。关键的是，JAH-糖蜜共同利用完全取代了所有基础培养基成分（碳源/氮源、无机盐），代表生产成本降低了 73%。在 PUM 系统中进行重复补料分批发酵，实现了最高 54.0 g/L 的 PMLA 滴度（0.75 g/(L·h) 的生产力），并在 4 个周期内保持稳定的产量。这种综合策略开创了一条通过低成本农业副产品和先进固定化技术实现工业 PMLA 生产的可持续、可扩展途径。

引言

聚 (β-L-苹果酸) (PMLA) 是一种天然存在的生物聚酯，具有可生物降解和生物相容性，由于其在中医学领域（例如药物递送系统、组织工程）和其他工业部门的广泛应用，引起了大量的工业兴趣 [1]、[2]。在微生物生产者中，丝壳菌属 (Aureobasidium) 的多个系统发育群已被鉴定为高效的 PMLA 合成器，能够积累高浓度的这种生物聚合物 [3]、[4]。代谢工程的最新进展集中在重构 PMLA 生物合成途径上，从而开发出了几种高产突变菌株 [4]、[5]、[6]、[7]。尽管取得了这些进展，商业化规模的 PMLA 发酵生产仍未实现，主要受到与传统底物和发酵系统相关的高制造成本的制约。

为了解决成本挑战，研究工作转向利用低成本原料，特别是基于淀粉的农业残留物和糖业副产品。例子包括红薯 [8]、甘蔗糖蜜 [9]、[10]、菊芋 (JA) [11]、大豆糖蜜 [12]、甘蔗汁 [13]、麦芽糖浆 [14]、液化玉米淀粉 [15]、木薯 [16] 和木糖母液 [17]。值得注意的是，菊芋是一种可再生的非谷物作物，作为生物炼制原料具有卓越的潜力，其特征是菊粉含量高、生长迅速、生物量大且环境适应性强——在不适合常规作物的边际土地（例如干旱、寒冷、盐碱和沙漠化土壤）上茁壮成长 [18]、[19]、[20]。仅中国就拥有 767 万公顷盐碱地，但由于其块茎菊粉含量超过干重的 70%（一种不可消化的水溶性膳食纤维 [20]、[21]），大规模菊芋种植仍未得到开发。虽然菊芋菊粉已被用于生产高价值化合物，如胞外多糖 [22]、利亚霉素 [19] 和 3-羟基丙酸 [20]，但其水解液也已被探索用于成本效益高的 PMLA 生产 [11]、[23]。然而，从菊芋水解液获得的最大报道 PMLA 滴度和生产力仅为 24.9 g/L 和 0.78 g/(L·h)（生物量为 80 g/L），并且由于水解液固有的促进细胞生长的特性，每单位生物量的 PMLA 产量（Y_p/x = 0.31）较低。糖蜜，另一种丰富且低成本的糖业副产品，含有 40–60% (w/w) 的可发酵糖（蔗糖、葡萄糖、果糖），全球年产量约为 3.5 亿吨 (Xu 等，2025) [24]。在中国，它作为一种主要的非食用农业副产品，预计到 2030 年产量将达到 1028 万吨 [25]、[26]。我们之前的工作通过优化的糖蜜预处理实现了 54.95 g/L 的 PMLA 滴度（生产力：0.76 g/(L·h)，生物量：82.85 g/L）[10]，但底物同样诱导了过多的细胞生长，限制了 PMLA 的产量效率。有趣的是，糖蜜富含无机离子（例如 SO?2?、Ca2?、Na?），可能调节微生物代谢，而菊芋水解液和预处理糖蜜各自都促进细胞增殖。Xia 等人 [11] 此前报道了使用菊芋水解液作为底物的高 PMLA 滴度 114.4 g/L；然而，他们的发酵系统仍需补充生产介质中的成分，包括氮源 (NaNO?)，并且没有采用细胞固定化来实现重复批次培养。与他们的研究相比，我们的综合策略实现了完全消除所有合成培养基添加剂，并通过固定化载体实现稳定的循环生产，这为实用工业化提供了互补的进展。这提出了一个新的假设，即共同利用这两种底物可以平衡细胞生长和 PMLA 合成——缓解单独使用底物的缺点，同时利用其互补的营养特性。我们的综合策略实现了所有合成培养基成分的完全取代，代表了向工业可行性发展的互补进展。

固定化技术进一步出现作为一种具有成本效益的策略，以提高生物工艺效率、稳定性和可扩展性，推动其在工业部门的广泛应用。先前的研究表明，丝壳菌群在聚氨酯 (PU) 泡沫 [27]、纤维床 [8]、[28] 和丝瓜络海绵 (LS) 基质 [10]、[23] 等载体上有效固定化。在这些材料中，合成基质如 PU 泡沫和植物纤维素海绵表现出优于农工业副产品（例如核桃壳、杏仁壳）和矿物材料（例如颗粒状天然斜发沸石）[27] 的固定化潜力。关键的是，PU 泡沫此前未被应用于 PMLA 生产，代表了提高工艺性能的未开发机会。为了填补这些研究空白，本研究提出了一种新型的综合策略：结合甘蔗糖蜜和菊芋的共同利用与黑耳丝壳菌在聚氨酯基质 (PUM) 中的固定化，以实现低成本、高效率的 PMLA 生产。具体目标是：(1) 评估不同 PU 材料对 PMLA 生产的影响，以 LS 作为对照，同时评估单独用甘蔗糖蜜或 JA 替代基础培养基营养物质的可行性；(2) 优化这两种底物的共同利用条件以提高 PMLA 生物合成效率；以及 (3) 评估使用 PUM 固定化黑耳丝壳菌从共同利用底物生产 PMLA 的稳定性。这项工作旨在通过将低成本原料与先进固定化技术相结合，为工业 PMLA 生产提供可持续和可扩展的解决方案。

章节片段

微生物、培养基和培养条件

本研究使用的菌株A. melanogenum CGMCC 编号 23225，保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心（中国北京）。培养条件和 PMLA 生产培养基与 Cao 等人 [29] 报道的方案一致。种子培养基 (w/v) 由 8% 葡萄糖、0.2% NaNO?、0.01% KH?PO?、0.02% MgSO?·7H?O、0.05% KCl 和 0.1% 胰蛋白胨 (LP0042, Oxoid LTD., Basingstoke Hampshire, UK) 溶解于去离子水中组成。对于烧瓶

不同 PU 材料对 PMLA 生产的影响

为了选择合适的聚氨酯 (PU) 材料用于在 PU 基质中固定化A. melanogenum 细胞，首先评估了不同 PU 的吸水能力和细胞（即生物量）吸附能力。如图 1a 所示，PU 的吸水能力 (g water/ cm³ PU) 随着孔径减小而逐渐增加，在 40 ppi PU 时达到最大值 4.4 g/cm3；此后，随着孔径进一步减小，它逐渐下降。生物量吸附能力

结论

本研究建立了一个高效、低成本的 PMLA 生产系统，使用固定在 PUM 中的A. melanogenum。甘蔗糖蜜和菊芋水解液的共同利用完全取代了合成培养基，平衡了细胞生长和产品合成。60 ppi 聚氨酯载体实现了稳定的重复补料分批发酵，PMLA 滴度达到 54.0 g/L 且具有高操作稳定性。这种综合策略为工业 PMLA 生产提供了一条可持续、可扩展的途径。

附录 A. 补充数据

用于 PMLA 生产的 PU 基质 (PUM) 系统示意图可在补充信息中找到。

CRediT 作者贡献声明

万银华： 监督。范荣： 方法论。乔长生： 监督。刘云云： 方法论。刘馨雨： 实验。雷俊浩： 实验。曹维锋： 概念化，资金获取，写作 – 审阅与编辑。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文中报道的工作。

致谢

作者感谢中国国家自然科学基金 (编号 22278412) 的财务支持。

雷俊浩 | 刘馨雨 | 刘云云 | 曹维锋 | 乔长生 | 范荣 | 万银华

天津科技大学生物技术学院，中国天津 300457