整合UPLC-Q-TOF MS/MS与计算分析鉴定来自Salaria basilisca蛋白水解物的抗氧化肽及其对粉唑醇诱导氧化应激的保护作用

《Results in Chemistry》：Integrated UPLC-Q-TOF MS/MS and computational analysis identify antioxidant peptides from Salaria basilisca protein hydrolysate with protection against flutriafol-induced oxidative stress

　　

本研究报道了利用UPLC-Q-TOF MS/MS方法鉴定来自斑马鳚蛋白水解物(ZBPH)超滤组分F2(10–30 kDa)的抗氧化肽，并研究了其在小鼠模型中对短时粉唑醇(FFL)诱导毒性的保护潜力，FFL是一种三唑类内吸性杀菌剂。共鉴定出十条不同的肽序列，其中八条经生物信息学分析预测具有抗氧化活性，提示其可能具有与抗氧化相关的生物活性。小鼠被分为五组(每组n = 10)：对照组、FFL处理组(25 mg/kg，自第10天起)，以及三个F2预处理组(50、100或200 mg/kg)预处理10天，随后F2与FFL联合处理至第15天。研究人员评估了血液学、生化和氧化应激标志物，包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢酶(CAT)和硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)，涉及多个器官(肝、肠、脑、肾、睾丸、肺、胰腺和心)。FFL处理小鼠显示出显著的血液学和生化改变、脂质过氧化增加和抗氧化酶活性降低，并伴有组织病理学损伤和DNA降解。F2预处理及联合给药显著恢复了抗氧化防御，将部分生化参数部分改善至正常水平，并减轻了组织损伤和DNA片段化。针对与氧化应激和炎症通路相关的蛋白进行分子对接分析，揭示了几种已鉴定肽具有良好的预测相互作用，尤其是肽5、6、8和10，这可能与实验中观察到的抗氧化效应有关。所选蛋白-肽复合物(10-3V99)的分子动力学(MD)模拟表明，该结构在整个模拟过程中保持稳定，并在100 ns内表现出极小的构象波动。此外，ADMET(吸收、分布、代谢、排泄和毒性)预测提示这些肽可能具有可接受的理论安全性特征，支持其进一步研究的潜力。总体而言，这些发现支持富含肽的F2组分对FFL诱导的氧化应激和器官毒性具有保护潜力。

论文解读：整合UPLC-Q-TOF MS/MS与计算分析鉴定Salaria basilisca蛋白水解物抗氧化肽及其对粉唑醇诱导氧化应激的保护作用

一、研究背景与目的

蛋白质是人体饮食的基本组成部分，在维持生理功能方面发挥着关键作用。除了作为必需氨基酸的来源，膳食蛋白质在酶解或胃肠道消化过程中可产生生物活性肽。这些肽在天然蛋白质结构中通常处于非活性状态，但一旦释放便具有生物活性，其效应取决于氨基酸组成、序列和分子量。越来越多的研究表明，生物活性肽可表现出抗氧化、抗菌、降压、抗炎、抗糖尿病、抗癌和免疫调节等多种生物学功能。

粉唑醇(Flutriafol, FFL)是一种三唑类内吸性杀菌剂，广泛用于防治谷物等作物的真菌病害。尽管具有重要的农业价值，但关于FFL在生物系统中毒理学效应的数据仍然有限。在啮齿动物中的实验研究表明，FFL暴露与体重下降、眼部病变、胎儿骨骼形成受损、呼吸道刺激、肝脏肥大、肝酶活性改变以及因其内分泌干扰特性导致的潜在生殖毒性有关。由活性氧(ROS)产生与抗氧化防御之间的失衡引起的氧化应激，已被认为是农药诱导毒性的关键机制。因此，基于抗氧化剂的干预策略被认为是减轻农药相关氧化损伤的有前景的方法。在此背景下，海洋生物尤其是鱼类，已被证明是抗氧化肽和蛋白水解物的丰富来源，具有潜在的治疗应用价值。已有许多研究将斑马鳚蛋白水解物(ZBPHs)确定为有效的天然抗氧化肽来源。然而，关于肽和蛋白水解物对杀菌剂诱导毒性的保护作用的研究仍然稀少，针对FFL诱导毒性的研究则更为缺乏。

因此，本研究首次旨在评估来自ZBPHs超滤组分F2(10–30 kDa)的肽对小鼠中短期FFL诱导毒性的保护和抗氧化潜力，并通过计算建模探索其潜在的分子机制和药理学相关性。


二、主要技术方法

本研究采用了多种实验和计算技术手段。研究人员利用超滤膜分级制备了富含生物活性肽的F2组分(10–30 kDa)。采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用(UPLC-Q-TOF MS/MS)技术对F2组分中的肽段进行鉴定。通过BIOPEP-UWM数据库进行生物活性的计算机(in silico)预测。研究人员建立了小鼠动物模型，设置了对照组、FFL处理组及三个不同剂量(50、100、200 mg/kg)F2预处理加联合处理组，评估了血液学参数、血清生化指标、多器官(肝、肠、脑、肾、睾丸、肺、胰腺、心)中的抗氧化酶(SOD、GPx、CAT)活性和脂质过氧化标志物(TBARS)水平，并进行了组织病理学检查和DNA片段化分析。此外，还利用HDOCK服务器进行了分子对接研究，使用Desmond软件包进行了100 ns的分子动力学(MD)模拟，并通过ADMET-AI平台预测了候选肽的吸收、分布、代谢、排泄和毒性(ADMET)特性。


三、研究结果

1. 富含生物活性肽的F2组分的制备及抗氧化活性
本实验室前期制备的斑马鳚蛋白水解物(ZBPH-Z)经截留分子量为30、10、5和1 kDa的超滤膜分级，得到五个组分。根据Ktari等人的研究，这些肽组分在多种体外抗氧化体系中表现出浓度依赖性的抗氧化活性，其中F2组分在所有测定中均表现出最强的抗氧化活性，因此被选中用于后续研究。

2. UPLC-Q-TOF MS/MS肽谱分析
通过UPLC-Q-TOF MS/MS分析，研究人员从F2组分的色谱图中选取了十个强度最高的峰进行MS/MS测序，鉴定了十条肽序列，其分子量约为1.1至1.9 kDa。值得注意的是，这与F2超滤截留液的标称分子量范围(10–30 kDa)不一致。研究人员解释这归因于超滤膜分离效率不仅取决于分子量，还受肽理化性质、构象及肽-膜相互作用的影响。独立的质谱分析在F2截留液中检测到了分子量约为11.40和11.52 kDa的完整蛋白质，证实了目标分子量范围内蛋白质的存在。

3. 肽生物活性的计算机预测
BIOPEP-UWM数据库分析结果显示，鉴定的肽表现出多种潜在生物活性。肽1(VSAKLGATLSK)具有多种预测活性，包括抗氧化、ACE抑制、DPP-IV抑制、脑啡肽酶抑制、丙氨酸羧肽酶抑制和降尿酸作用。肽3和肽6未预测到活性。抗氧化潜力是最常见的功能，肽2、4、5、7、8、9和10均显示出抗氧化活性，证实了ZBPH-Z F2组分具有较强的抗氧化能力。

4. 富含生物活性肽的F2组分对FFL诱导毒性的保护作用
(1)血液学参数
FFL处理小鼠的白细胞(WBCs)计数显著增加，而红细胞、血红蛋白、红细胞压积等参数无显著变化。F2预处理及联合给药以剂量依赖方式使WBCs及其他血液学参数恢复至正常水平。血涂片观察结果支持了这些发现。

(2)肝脏毒性指标
FFL给药导致血清ALAT和ALP活性升高(分别比对照组高19.43%和12.12%)，但统计分析无显著差异。F2预处理及联合给药显著降低了ALAT和ALP活性，使其恢复至接近正常水平，提示其肝保护机制可能涉及抑制脂质过氧化、调节细胞色素P-450活性和稳定肝细胞膜。

(3)肾脏毒性指标
FFL处理小鼠的肌酐和尿酸水平分别升高33.01%和11.08%，但组间无显著差异。F2预处理及联合给药使这些指标恢复至接近对照组水平。

(4)心肌酶
FFL处理小鼠的CPK、LDH和ASAT活性分别升高20%、11.47%和7.82%。F2联合处理使这三项指标保持或恢复至接近正常水平，提示通过膜稳定和抑制脂质过氧化发挥心脏保护作用。

(5)血清脂质水平
FFL处理小鼠的血清总胆固醇(TC)显著升高18.64%(p = 0.030)。F2预处理及联合给药后，TC水平在不同剂量下分别降低了28.57%、25.71%和30.57%，而HDL-C水平分别增加了40.83%、25%和39.16%，表明肽能够改善高脂血症。

(6)抗氧化酶和脂质过氧化
FFL处理导致肝、肠、脑、肾、睾丸、肺、胰腺和心脏组织的SOD、CAT和GPx活性显著降低，同时TBARS水平显著升高，表明氧化应激的确立。F2联合处理可使CAT、GPx、SOD活性和TBARS水平几乎恢复至对照组水平，表明F2消除了FFL的毒性效应。

(7)组织病理学评估
肝、肾、肠和肺的组织病理学检查显示，FFL处理导致肝组织明显炎症和空泡充血形成；肾组织白细胞浸润、肾小囊腔扩大和血管充血；肠组织严重炎症伴明显血管充血；肺组织出现明显肺泡气肿。F2预处理及联合给药(50、100、200 mg/kg)显著减轻了这些组织损伤，组织学形态与对照组相似。

(8)组织DNA片段化
琼脂糖凝胶电泳结果显示，对照组小鼠组织DNA完整无弥散，而FFL处理小鼠出现DNA smear，表明DNA降解。F2预处理及联合给药后，DNA smear消失，表明F2可防止FFL诱导的DNA损伤。

5. 计算分子对接及ADMET建模研究
(1)分子对接分析
分子对接结果显示，大多数肽与四个靶蛋白(1DGH、2C9V、5H5Q和3V99)具有良好的结合能。其中肽5、6、8和10表现出最佳对接分数。肽10对1DGH、2C9V和3V99三个靶标均表现出持续的良好结合能力，结合能分别为?219.09、?236.96和?239.82 kcal/mol。肽5与5H5Q的结合能为?167.68 kcal/mol，并与其他靶标形成高度稳定的复合物。相互作用分析显示，氢键在稳定所有选定复合物中起主导作用，疏水接触和静电相互作用也促进了复合物的稳定性。

(2)分子动力学模拟
对选定的蛋白-肽复合物(10-3V99)进行的100 ns MD模拟显示，该复合物在整个模拟期间保持稳定。RMSD值在2.0至3.5 ?之间波动，未见显著结构偏差；RMSF分析显示大多数蛋白残基相对稳定；回旋半径(Rg)分析显示蛋白和肽均保持一致的致密性；溶剂可及表面积(SASA)在31,000–33,000 ?2范围内仅有微小波动。所有结果表明该蛋白-肽复合物在100 ns分子动力学模拟中结构稳定且结合良好。

(3)ADMET研究
ADMET-AI平台的预测结果显示，所有肽均表现出高分子量和极性表面积，这是肽类化合物的特征。肽10显示出相对较优的理化性质，包括较低的分子量、较低的拓扑极性表面积和较不疏水的LogP值。所有肽的吸收相关参数均预测较低，与肽的亲水性一致。分布分析显示中等的血浆蛋白结合率，肽10的预测结合率相对较低，可能有利于全身分布。所有肽的血脑屏障穿透性均预测为极小。毒理学评估表明，三种肽均具有可接受的安全特征，急性毒性(LD50)值表明低急性毒性潜力。但研究人员指出，ADMET-AI模型主要针对小分子优化，对较大肽结构的预测准确性可能有限，这些结果应视为初步预测指标。


四、讨论与结论

本研究的讨论部分指出，FFL处理引起的氧化应激是多器官毒性的关键机制。F2组分的保护作用可能归因于其含有的抗氧化肽能够清除自由基、增强抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化。分子对接和MD模拟结果支持了特定肽(尤其肽5和10)与抗氧化相关靶蛋白的稳定结合，为其抗氧化活性提供了分子层面的解释。ADMET预测结果初步表明这些肽具有可接受的安全性特征。该研究存在一些局限性，如未设置F2单独处理组和参考抗氧化剂组，组织病理学评估缺乏盲法半定量评分系统，以及ADMET预测模型对肽类化合物的适用性有限。

综上所述，本研究首次阐明了来自ZBPH-Z F2组分的肽对FFL所致小鼠组织损伤的保护作用。研究结果表明，这些肽通过改善生化参数、代谢谱、抗氧化酶活性、DNA降解和组织病理学变化，具有显著的抗氧化和治疗潜力。鉴于其显著的生物活性，富含肽的F2组分具有作为天然抗氧化肽来源掺入功能食品或膳食配方的巨大潜力。分子对接分析揭示肽10和肽5对多个靶标表现出强结合亲和力，ADMET预测进一步支持其良好的安全性特征，验证了肽10和肽5作为有前景的先导肽，并强调了整合对接-ADMET筛选在肽类药物发现中的有效性。