镧掺杂红色碳点对溶菌酶淀粉样纤维化的构象调节与抑制：多光谱、形态学及分子模拟研究

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Conformational modulation and inhibition of lysozyme amyloid fibrillation by lanthanum-doped red carbon dots: a multispectroscopic, morphological, and molecular simulation study

　　

摘要

本研究探讨了稀土掺杂碳纳米材料与淀粉样蛋白质之间的分子相互作用。通过一锅水热法合成了红色发光的镧掺杂碳点（La-CDs），其在603 nm处表现出强荧光，绝对量子产率为23.57%，且具有优异的光学稳定性。我们采用结合多光谱技术、热力学分析、分子对接和分子动力学模拟的综合方法，系统研究了La-CDs与蛋清溶菌酶（HEWL）的结合。La-CDs以中等亲和力（~ 10⁴ L·mol^?1）特异性结合于远离催化中心的非催化表面口袋，主要由氢键和范德华相互作用驱动。热力学分析表明该过程为自发的焓驱动过程（298 K下ΔH = ?33.33 kJ·mol^?1；ΔG = ?25.83 kJ·mol^?1）。结合使α-螺旋含量增加（从29.8%增至32.1%），β-折叠含量降低（从22.2%降至18.9%），变性焓降低61.3%，但未改变熔融温度。在功能方面，La-CDs有效抑制了HEWL淀粉样纤维的形成，延长了成核滞后期，降低了延伸速率，并使最终纤维产量降低19.79%。该抑制作用以及预形成成熟纤维的解聚通过透射电子显微镜得到了形态学验证。此外，La-CDs对HepG2细胞表现出低细胞毒性（100 μg·mL^?1时活力>80%），并能实现细胞内红色荧光成像，共定位研究证实了其优先在线粒体中蓄积。值得注意的是，La-CDs通过将HepG2细胞从HEWL纤维诱导的毒性中解救出来，表现出有效的细胞保护作用。这些发现推进了对纳米材料-蛋白质界面行为的基础理解，并确立了La-CDs作为抗淀粉样治疗中前景广阔的构象调节剂的地位。

引言

稀土掺杂碳点（CDs）因其独特地将镧系离子的光学和电子特性与碳基纳米材料的优良生物相容性相结合，在纳米生物医学领域引起了广泛关注。特别是镧掺杂红色发射碳点（La-CDs），通过将La³⁺离子掺入碳核或表面配位位点来合成，从而将发射波长移至红光至近红外光谱区域。这一光谱特性显著提高了光在生物组织中的穿透能力，并有效规避了内源性自发荧光的干扰，使La-CDs在生物成像和生物传感应用中具有特别的优势[1], [2], [3]。镧的引入还优化了电子跃迁路径，从而同时提高了光致发光量子产率和光学稳定性。此外，丰富的表面官能团，如氨基、羧基和羟基基团，为进一步的功能化提供了多样化的化学位点。先前的研究表明，La-CDs在抗肿瘤治疗中具有潜在应用价值，例如通过抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖和迁移[4]，以及在伤口愈合中作为抗菌复合敷料的组成部分[5]。然而，当这些纳米材料被引入生理环境时，不可避免地会与生物大分子发生界面相互作用，这一过程可能干扰蛋白质构象、损害酶功能，甚至引发病理性聚集。遗憾的是，目前关于La-CDs的研究主要集中在评估细胞水平的表型结果上，对我们理解这些纳米材料在分子水平上如何与关键功能酶相互作用以及此类相互作用是否能诱导有益的构象调节以对抗病理性聚集存在明显空白。

为弥补这一知识空白，选择合适的模型蛋白质至关重要。溶菌酶之所以能出色地胜任这一角色，有以下几个原因。首先，其空间结构明确，由α和β两个结构域组成，两个结构域之间通过涉及残基间β-折叠相互作用的氢键网络相互连接，并进一步由四个共价二硫键桥稳定；因此，控制其构象稳定性的调节机制已得到明确界定[6], [7]。这种明确的结构使溶菌酶成为探测外部因子介导的非催化表面构象调节的理想候选蛋白。其次，人类溶菌酶基因的显性突变与遗传性系统性淀粉样变性有因果关系，其中错误折叠的溶菌酶变体以淀粉样纤维的形式沉积在肝脏和肾脏等重要器官中[8]。因此，溶菌酶是已知唯一具有内在淀粉样纤维形成能力的酶，其聚集途径已成为研究蛋白质错误折叠疾病（包括阿尔茨海默病和帕金森病）的经典分子模型[9]。第三，鸡蛋清溶菌酶（HEWL）在三维结构、催化机制和淀粉样纤维形成行为方面与其人源对应物高度保守，序列同一性约为60%，被广泛接受为体外研究蛋白质折叠和聚集动力学的标准替代物[10], [11]。因此，探索La-CDs如何调节HEWL的构象、热稳定性和淀粉样纤维形成，不仅将阐明La-CD与生物大分子相互作用的基本原理，还将为评估其潜在神经毒性或抗淀粉样相关病理的治疗价值提供直接证据。

对现有文献的深入考察表明，纳米材料对溶菌酶淀粉样纤维形成的调节效应具有高度的材料特异性。例如，氨基酸功能化的氧化铁纳米颗粒已被证明能有效抑制溶菌酶纤维形成，甚至解聚成熟纤维[12]，而二氧化硅纳米颗粒则被报道对纤维化产生矛盾的促进作用，这可能是通过优先吸附到HEWL的非淀粉样区域，间接暴露聚集倾向片段于溶剂所致[13]。这些看似矛盾的发现凸显了一个关键认识：纳米材料的表面化学、粒径和掺杂元素的细微变化可以决定影响溶菌酶构象平衡和聚集轨迹的显著不同的分子机制。尽管La-CDs具有独特的光学性质和表面特征，但据我们所知，它们通过非活性位点结合调节溶菌酶构象的潜力以及由此对淀粉样纤维形成过程产生的后果尚未得到系统记录。

为系统阐明La-CDs与HEWL相互作用的分子机制并评估其对酶构象、热稳定性和淀粉样纤维形成的调节效应，本研究采用了将实验光谱学、热力学和动力学与理论分子模拟紧密结合的多维度研究策略，并辅以形态学表征（透射电子显微镜，TEM）和生物学评估（细胞保护实验）。通过这一综合研究，我们确定了精确的结合位点，表征了主要的分子间力，并勾勒出界定La-CDs ? HEWL复合物的热力学特征，与非催化表面结合模式一致。本研究进一步阐明了La-CDs调节HEWL二级结构组分和整体构象稳定性的具体方式，并建立了这些调节效应与观察到的淀粉样纤维形成减弱之间的内在机制联系。此外，我们提供了纤维抑制和解聚的直接形态学证据，并验证了La-CDs对抗纤维诱导的细胞损伤的功能性细胞保护潜力。总之，这些发现为理解稀土掺杂碳点在生物环境中的界面行为提供了基本数据，为纳米生物安全的严格评估提供了关键参考点，并为理性设计具有潜在抗淀粉样相关病理治疗应用的La-CD基纳米材料提供了结构依据和指导原则。

章节摘要

材料

氯化镧（LaCl₃·xH₂O）购自国药集团化学试剂有限公司。HEWL购自上海生工生物工程有限公司，溶于10 mM磷酸盐缓冲液（PBS，pH 6.5）[14]。2,5-二氨基甲苯硫酸盐（MSDS）、腺苷5'-单磷酸二钠六水合物（AMP）、硫黄素T（ThT）及其他试剂购自上海麦克林生化科技有限公司。细胞计数试剂盒-8（CCK-8）购自日本Dojindo Laboratories（熊本，

La-CDs的合成与表征

通过系统改变前驱体化学计量比、镧负载量、反应温度和反应时间，确定了La-CDs的最佳合成条件。当AMP与MSDS的摩尔比为1:2，LaCl₃·xH₂O用量为0.0735 g，在170 °C下水热处理3 h时，获得了最高的荧光强度（图1A?D）。所得La-CDs的激发和发射最大值分别位于570 nm和603 nm处，对应的Stokes位移约为

结论

本研究阐明了La-CDs与HEWL相互作用的分子机制。所合成的La-CDs表现出优良的光学性质，包括适用于深层组织成像的603 nm红移发射和高绝对量子产率23.57%，这归因于La³⁺离子在碳点表面的配位。La-CDs通过氢键和范德华力结合于非催化表面口袋，形成远离催化中心的稳定1:1复合物。这种

利益冲突声明

作者声明不存在任何已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文所报告的工作。

致谢

本工作获得广西壮族自治区自然科学基金（2025GXNSFAA069589、2024GXNSFDA010036）、国家自然科学基金委员会（22463008、U23A2089）和广西研究生教育创新项目（JGY2024264）的经费资助。

黄珊|张世勤|涂新聪|潘春燕|方怡|魏福祥|肖琦