基于铜纳米团簇聚集诱导发光的酸性磷酸酶荧光传感器

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Fluorescent sensor for acidic phosphatase based on aggregation induced emission of copper nanoclusters

　　

摘要

铜纳米团簇（CuNCs）具有聚集诱导发光（AIE）特性，凭借其优良的光学性能和良好的生物相容性，在生物传感领域展现出广阔的应用前景。然而，常见的AIE诱导策略如溶剂效应和限域效应缺乏特异性或需要复杂的结构设计，限制了其在实际生物传感中的应用。为解决这些问题，本研究设计了一种基于CuNCs与三磷酸腺苷（ATP）配位的荧光生物传感器，用于高效检测酸性磷酸酶（ACP）。ATP通过静电作用和氢键诱导CuNCs聚集，形成片状组装结构并触发AIE效应，使体系荧光显著增强。当存在ACP时，ATP被催化水解为二磷酸腺苷（ADP）和无机磷酸，导致聚集体解离，荧光强度降低。该策略以ATP为桥梁，将酶促反应直接转化为荧光信号变化，操作简便且灵敏度高。

引言

酸性磷酸酶（ACP）是一种在人体中普遍存在的生物酶，可在酸性条件下催化脱磷酸化反应。它能有效催化磷酸酯的水解，释放出游离磷酸基团，从而参与病原体清除、免疫防御增强和铁转运等多种生理活动[1]、[2]。ACP表达水平的失调与多种疾病相关，其异常升高可作为甲状旁腺功能亢进、肝炎、多发性骨髓瘤和癌症等疾病的预测指标[3]、[4]、[5]。因此，监测ACP活性对于诊断相关疾病至关重要，亟需开发简便、灵敏且准确的ACP活性检测分析策略。

具有聚集诱导发光（AIE）特性的金属纳米团簇（MNCs）已作为一种新型光致发光纳米材料崭露头角。MNCs是由金属中心和配体组成的分子水平聚集体，具有超小尺寸，表现出类似于分子的离散电子能级和轨道跃迁。它们拥有优异的光致发光性能、大的Stokes位移、长寿命载流子寿命（微秒级）、可调组成、可定制表面化学性质以及良好的生物相容性[6]、[7]、[8]。与传统在高浓度下发生聚集导致猝灭的发光材料不同，AIE型发光MNCs在稀溶液中发光微弱，但在浓度增加或发生聚集时则表现出明亮发光[9]。这种独特的光学行为与其表面壳层和金属核的可设计性相结合，使得能够制备具有AIE特性的定制MNCs以满足特定功能需求[10]、[11]、[12]。目前，关于金纳米团簇（AuNCs）和银纳米团簇（AgNCs）的AIE相关特性研究已较为成熟[13]、[14]、[15]，而铜纳米团簇（CuNCs）在此方面的报道仍较为匮乏。此外，与AuNCs和AgNCs相比，CuNCs本身荧光量子产率较低且稳定性较差。因此，AIE效应显著改善了CuNCs的荧光性能，进一步拓展了其在光学相关领域的应用[16]。

AIE效应作为增强CuNCs荧光和稳定性的常用策略，其核心机制如下：当CuNCs聚集时，分子内旋转和拉伸等运动受到抑制，导致这些运动消耗的能量减少，从而实现荧光增强[17]。常见的AIE触发方法有以下几种：(1) 溶剂效应，利用溶剂诱导CuNCs形成有序组装体[18]；(2) 限域效应，采用金属有机框架（MOFs）[19]和层状双氢氧化物（LDHs）[20]等二维或三维结构材料来触发CuNCs的AIE效应，克服CuNCs稳定性差和发光强度低的问题；(3) 静电吸引，使用带相反电荷的材料通过静电作用诱导CuNCs产生AIE效应[21]；(4) 金属离子掺杂，通过掺杂金属离子触发单分散CuNCs形成更大尺寸的聚集体[22]、[23]。尽管其中一些方法能有效诱导CuNCs产生AIE并改善其荧光性能，但缺乏相应的特异性或需要设计复杂的检测策略，限制了这些CuNCs在生物传感领域的应用[24]、[25]。因此，如何通过AIE显著改善CuNCs的荧光性能，同时实现相应生物传感器设计中的特异性和简便性，是当前CuNCs的AIE相关研究的关键焦点。

在本研究中，构建了基于CuNCs的荧光生物传感器用于检测人血清中的ACP。与电化学传感和比色传感相比，荧光传感具有高灵敏度、高通量和低成本的优势。如图1所示，三磷酸腺苷（ATP）通过静电作用和氢键相互作用诱导荧光CuNCs聚集形成大的片状聚集体，显著增强了CuNCs的荧光。另一方面，ATP作为ACP的底物分子，可被ACP水解生成二磷酸腺苷（ADP）和Pi。因此，当CuNCs/ATP体系与ACP共孵育时，ATP的水解破坏了CuNCs的片状聚集结构，导致荧光强度降低。ATP的桥梁作用便于开发用于直接检测ACP的荧光传感器。

各节摘要

化学试剂与材料

无水硫酸铜（CuSO₄）和多巴胺盐酸盐（DA）购自麦克林生化科技公司（中国上海）。谷胱甘肽（GSH）、氢氧化钠（NaOH）、三磷酸腺苷（ATP）、抗坏血酸（AA）、半胱氨酸（Cys）、4,6-二氨基-2-巯基嘧啶（DAMP）和葡萄糖（Glu）购自阿拉丁生化科技公司（中国上海）。酸性磷酸酶（ACP）购自源叶生物科技有限公司（中国上海）。葡萄糖氧化酶（GOx）

CuNCs的表征

本研究采用一锅水热法合成了CuNCs。CuNCs的TEM图像如图1A所示。所合成的CuNCs在水溶液中均匀分布并表现出单分散性，平均粒径约为2 nm。高分辨TEM图像显示CuNCs具有清晰的晶格条纹（图1B），测得晶格间距为0.212 nm，属于金属Cu面心立方晶结构的典型(111)晶面。

结论

在本工作中，我们开发了一种基于CuNCs/ATP复合物的ACP荧光检测平台。一方面，ATP诱导CuNCs产生聚集诱导发光（AIE）效应。另一方面，ACP的加入可水解ATP，导致CuNCs/ATP复合物的聚集结构被破坏，荧光强度降低。ATP既是CuNCs的荧光增强分子，也是ACP的催化底物。该荧光传感器表现出良好的线性

作者贡献

杨海霞：调查研究、数据管理、撰写初稿。马方辉：概念构思、监督指导、调查研究、撰写审阅与编辑。杨明辉：资金获取、项目管理、监督指导、撰写审阅与编辑。李小青：项目管理、监督指导、撰写审阅与编辑。

参与知情同意

我们还就任何涉及人血清样本的实验获得了知情同意。

伦理审批

所有实验均符合中国国家卫生研究院的指南，并获得了中南大学机构伦理委员会（IEC）的批准。

资金支持

作者感谢国家自然科学基金委员会（项目编号：22174163）和湖南省自然科学基金（项目编号：2023JJ70059）对本工作的支持。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文所报道工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

杨海霞|马方辉|杨明辉|李小青