线粒体定位的G-四链体响应性荧光配体的光动力活性：细胞效应与光增强细胞毒性

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Photodynamic activity of a mitochondria-localized G-quadruplex-responsive fluorescent ligand: Cellular effects and photo-enhanced cytotoxicity

　　

摘要

线粒体定位使光敏分子集中在氧化还原敏感细胞器附近。在本研究中，我们研究了 SPN，一种线粒体靶向的 G-四链体 (G4) 响应性配体。光化学表征证实，SPN 能产生强大的光触发活性氧 (ROS)，并在体外表现出光氧化活性。在黑暗条件下的癌细胞模型中，SPN 处理与细胞周期紊乱、线粒体膜电位丧失、线粒体形态改变、线粒体超氧阴离子敏感荧光升高以及 MDC 阳性自噬小泡的积累有关。白光照射在较短的孵育时间和较低的 SPN 浓度下，显著增强了细胞内氧化敏感荧光并降低了细胞活力。在机制上，SPN 加光照与 NDUFB8 和 SDHB 丰度降低以及裂解型 caspase-3 水平升高有关，这与线粒体呼吸链紊乱和凋亡信号传导一致。总之，这些结果确立了 SPN 的光动力活性，并确定线粒体应激和与 caspase-3 相关的凋亡是其细胞反应的核心组成部分。

引言

癌症仍然是全球主要的健康挑战。手术、化疗和放疗在某些临床环境中有效，但可能受限于治疗相关毒性以及在晚期疾病中的不完全反应 [1]。光动力治疗 (PDT) 通过光激活光敏剂 (PS) 提供空间和时间的控制，随后通过 I 型和/或 II 型光化学途径产生细胞毒性活性物质 [2], [3], [4], [5]。PDT 的治疗性能取决于 PS 的光物理性质、细胞内分布和生物相容性 [6], [7]。因此，目前的策略强调亚细胞细胞器定位 [8], [9], [10]、分子响应性 PS 设计 [11] 以及联合方案 [12], [13], [14], [15]，以提高光动力疗效。

线粒体在生物能量学、氧化还原调节和细胞死亡信号传导中发挥核心作用。因此，维持线粒体 DNA (mtDNA) 对线粒体稳态至关重要 [16], [17], [18], [19], [20]。mtDNA 的鸟嘌呤富集区域可以采用 G-四链体 (G4) 构象，这可能影响复制和转录 [21], [22], [23], [24]。已开发了一系列荧光配体来识别线粒体 G4 结构并可视化其细胞分布 [25], [26], [27], [28], [29], [30]。一些线粒体定位的 G4 配体也表现出抗增殖活性，尽管有效的反应通常需要相对较高的浓度或长时间的暴露 [31], [32], [33], [34], [35]。将这些荧光配体与光依赖的光化学相结合，可能会通过将有丝器相关的成像与外部控制的氧化应激相结合来拓宽其功能范围。

在本工作中，我们评估了 SPN，一种由我们小组开发的线粒体定位、G4 响应性荧光配体 [36]，作为光敏剂。使用氧化敏感分子探针 ABDA 和 TEMP-ESR 对其光化学行为进行了表征。细胞实验检查了黑暗下的细胞毒性、光照增强的活力丧失、线粒体膜电位、线粒体形态、ROS 敏感荧光、OXPHOS 蛋白丰度、液泡染色和裂解型 caspase-3。结果表明 SPN 表现出光动力活性，且光照暴露加剧了线粒体应激和细胞死亡相关反应。本研究将先前表征的 G4 响应性成像配体的应用扩展到线粒体相关 PDT，并为未来评估细胞内 G4 结合对光动力反应的贡献提供了基础。

章节片段

试剂和通用信息

化学物质和试剂购自 Sigma-Aldrich、阿拉丁或麦克林，除非另有说明，否则直接使用。细胞系购自 Procell（中国武汉）。JC-1 线粒体膜电位检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司（中国北京）。细胞培养容器购自洁特生物过滤有限公司（中国广州）。DAPI、Mito-Tracker Green、Calcein-AM/PI 染色试剂盒、活性氧物种

SPN 的光化学评估

此前有报道指出，SPN 能结合并稳定选定的 mtDNA G4 序列，并在细胞中表现出 G4 响应性荧光 [36]。为了建立实验基线，图 S3 通过光谱、热熔化和 Braco-19 竞争实验重新证实了 SPN 的代表性生物物理性质，提供了将 SPN 归类为 G4 响应性荧光配体的必要背景表征。因此，下文描述的细胞实验专注于评估

结论

总之，SPN，一种线粒体靶向的 G4 响应性配体，表现出黑暗下的细胞毒性和依赖光的光动力活性。光化学表征证明 SPN 具有强大的光触发 ROS 产生能力和光氧化能力。在癌细胞中，照射显著增强了细胞内氧化敏感荧光，导致线粒体膜去极化、形态破坏、NDUFB8 和 SDHB 丰度降低、积累

CRediT 作者贡献声明

Yakun Wang: 撰写 - 原稿，可视化，资源，方法论，调查，正式分析，概念化。Jiapeng Dong: 方法论，调查，正式分析，概念化。Hongshan Xie: 正式分析，调查，方法论。Guining Cao: 方法论，正式分析，概念化。Zhenxing Pan: 方法论，软件，数据管理，可视化。Niping Chen: 可视化，资源，方法论。Wing-Leung Wong: 撰写 - 审阅与编辑，监督。

利益冲突声明

作者声明他们没有任何已知的竞争性经济利益或个人关系可能会影响本文报告的工作。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（32171314）和广东省基础与应用基础研究基金会（2024A1515011666 和 2022A1515010671）的资助。我们要感谢广东工业大学分析测试中心在部分测试仪器方面提供的支持。我们也对香港理工大学深圳研究院的贡献表示感谢。

Yakun Wang|Jiapeng Dong|Hongshan Xie|Guining Cao|Zhenxing Pan|Niping Chen|Wing-Leung Wong|Yan He|Xujie Liu

广东工业大学生物医药学院，中国广州 510006