基于荧光铁掺杂聚合物纳米点纳米酶的级联反应用于α-葡萄糖苷酶活性及抑制剂检测

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Fluorescent iron-doped polymer dot nanozyme-based cascade reaction for α-glucosidase activity and inhibitor detection

　　

摘要

α-葡萄糖苷酶（α-Glu）活性及其抑制剂的准确定量对糖尿病诊断和药物筛选至关重要。通过开发基于涉及纳米酶的级联反应的检测方法可检测酶活性。然而，此类级联反应通常仅产生一种信号，而研制多功能纳米酶仍是一大挑战。本研究在温和条件下通过一锅法合成了铁掺杂荧光聚合物点（Fe-PDs）。铁的掺杂加速了PDs的形成，并赋予该材料显著的过氧化物酶（POD）样活性。所制备的Fe-PDs可催化H₂O₂氧化无色的TMB生成显色产物oxTMB，进而通过内滤效应（IFE）淬灭Fe-PDs的本征荧光。借助α-Glu、葡萄糖氧化酶（GOx）和POD的三催化酶级联催化，本研究构建了一个高灵敏度的比色-荧光双模态检测平台。通过引入对-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）作为底物，该系统可定量分析H₂O₂、葡萄糖、α-Glu活性及α-Glu抑制剂。得益于级联反应诱导的信号放大效应，该双模态检测方法可实现α-Glu活性的定量分析，线性范围为0.2–20 mU/mL（比色法）和0.2–25 mU/mL（荧光法），检测限分别为0.10和0.094 mU/mL。此外，该方法可实现α-Glu抑制剂（AGIs）的筛选及实际样品中AGIs的测定，与传统PNPG法相比表现出良好的吻合性，为临床诊断和抗糖尿病药物研发展现出广阔的应用前景。

引言

糖尿病以高血糖为特征，已成为全球性的健康问题。该病伴有多种严重并发症，如肾脏疾病、心血管疾病和视网膜病变。[1], [2] 2024年全球糖尿病患者已达5.89亿，其中超过90%属于II型胰岛素抵抗型糖尿病（T2D）。预计这一数字到2050年将急剧上升至8.53亿。[3], [4] α-葡萄糖苷酶（α-Glu）位于小肠黏膜的刷状缘膜上，是参与血糖（Glu）调控的关键酶之一。[5] 它通过水解α-吡喃糖苷键来分解和消化碳水化合物及二糖，从而提高血糖水平。[6] 近年来，α-Glu抑制剂（AGIs）被广泛用于帮助T2D患者通过抑制酶活性来控制血糖水平。[7], [8] 因此，开发先进的糖尿病疗法迫切需要简单、高效、可靠的分析策略，以准确测定α-Glu活性和筛选AGIs。[7], [9], [10]

迄今为止，已建立了多种用于α-Glu活性检测和AGIs筛选的技术，包括高效液相色谱、[11] 电化学技术、[12] 比色法、[13] 和基于荧光的方法。[14] 其中，比色法和荧光法因其操作简便、成本低廉和可视化检测能力而备受关注。传统比色法采用对-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷（PNPG）作为底物，该底物经α-Glu水解后生成对硝基苯酚（pNP）。[15] 产物在400 nm处显示特征吸收峰，从而便于评估α-Glu活性。[16], [17] 最近，几种多酶级联反应通过不同酶的协同作用，可显著提高生物传感系统的灵敏度、选择性和通用性。[18], [19], [20] Chiang等人开发了一种利用葡萄糖氧化酶（GOx）和辣根过氧化物酶（HRP）的双酶级联系统，用于灵敏检测葡萄糖。[21] 由于蛋白酶易失活且制备复杂，酶级联反应在生物传感中的应用潜力受到严重限制。[22], [23] 相比之下，纳米酶具有显著优势，包括优异的稳定性、高催化效率和低制备成本，使其成为构建先进多酶级联生物传感系统的天然酶理想替代品。[24], [25] Xin等人开发了具有过氧化物酶（POD）样活性的ZnIrOx/ZnIrMOFs纳米酶，并建立了GOx/ZnIrOx/ZnIrMOFs级联系统用于检测葡萄糖。[26] 然而，这些基于纳米酶的级联系统大多以单模态检测为主，容易受到环境或仪器波动的不准确影响。

碳点（CDs）作为碳纳米材料的典型类别，凭借其高稳定性、低毒性、独特的荧光性质和丰富的官能团，在研究中备受关注。研究表明，掺杂杂原子的CDs，特别是掺入过渡金属原子的CDs，可作为高效的纳米酶，展现出与其天然对应物相当的催化活性。[27], [28], [29] 然而，其合成往往复杂且需要苛刻条件，如高温高压。聚合物点（PDs）作为一种新兴的CDs，可在相对温和的条件下高产率合成，同时保持CDs的优势。[30] 它们通常通过自下而上的方法制备，经历含有CO、CN、CO和氨基等功能基团的前体分子之间的聚合和交联。[31] 值得注意的是，富含CO键和氨基官能团的聚乙二醇胺（PEI）、有机硅试剂和天然多酚已被广泛用作制备PDs的理想前体。这种流行主要源于它们丰富的反应位点和强大的交联能力，这使得在温和加热或室温反应条件下即可轻松合成PDs，无需苛刻的高压或强酸/碱环境。[31], [32], [33] 受此启发，有望制备具有荧光性质和催化活性的PDs，并将其应用于多酶级联系统中，以建立双模态检测平台。

在此，我们报道了一种在温和条件下，以PEI、对-苯二胺（PPD）和FeCl₃为原料快速一步合成铁掺杂聚合物点（Fe-PDs）的方法。掺入的铁加速了前体的聚合和交联，并作为催化活性位点。Fe-PDs在520 nm处发出黄绿色荧光，并表现出POD样活性。动力学研究表明其具有较低的K_m和较高的V_max，表明其具有更好的底物亲和力和转化效率。它们催化H₂O₂氧化TMB生成蓝色的oxTMB，进而通过内滤效应（IFE）淬灭其荧光，从而产生吸收和荧光的改变。显然，这一现象有潜力检测H₂O₂或葡萄糖（后者可在GOx作用下生成H₂O₂）。更重要的是，α-Glu可水解PNPG生成葡萄糖，从而引发级联反应，且吸收和荧光强度的变化与α-Glu活性相关。受此启发，我们利用兼具荧光和POD样活性的Fe-PDs建立了一个双模态三催化酶级联系统，该系统不仅能评估α-Glu活性，还可用于评估其抑制剂。在本工作中，我们不仅实现了α-Glu活性检测和抑制剂筛选，还进一步将该方法扩展至市售药片（阿卡波糖片和桑枝生物碱片）的定量分析。通过单因素方差分析与PNPG参考方法进行比较验证，结果P > 0.05。因此，这种具有操作简便、响应机制清晰和双信号产生简单等优点的检测平台，为多功能生物传感技术在疾病诊断和药物研发中的推进提供了有价值的见解。

章节摘要

材料

聚乙二醇胺（PEI）和对-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）购自麦克林生物技术有限公司（中国上海）。来自电鳗的乙酰胆碱酯酶（AChE）和来自黑曲霉的葡萄糖氧化酶（GOx）（批号：027H1112）购自Sigma-Aldrich公司（美国密苏里州圣路易斯市）。牛血清白蛋白（BSA）、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺二盐酸盐（TMB）和来自酵母的α-葡萄糖苷酶（α-Glu）购自源叶生物技术有限公司（中国上海，

Fe-PDs的合成与表征

Fe-PDs通过一锅法策略在温和条件下合成，以PEI和PPD为前体并添加Fe³⁺（图1A）。所制备的Fe-PDs表现出明亮的黄绿色荧光的荧光性能。相比之下，在相同条件下未添加Fe³⁺制备的体系仍为非荧光混合物。只有在将反应延长至两天后才检测到荧光（图1B）。这一现象可归因于Fe³⁺触发的氧化

结论

综上所述，我们在温和条件下通过简单操作，成功制备了以PEI和PPD为前体的新型Fe-PDs。将铁引入反应加速了反应的进行，并使Fe-PDs表现出POD样活性。此外，Fe-PDs具有本征的POD样活性，可催化无色的TMB在H₂O₂协助下氧化生成oxTMB，从而引发Fe-PDs的荧光淬灭。在此基础上，通过

CRediT作者贡献声明

宗成张：撰写初稿，形式分析，方法论，概念化。宇王：方法论，数据管理，形式分析。菲菲王：调查，验证。宇树李：撰写审阅与编辑，形式分析，经费获取。李军马：撰写审阅与编辑，监督。健孙：撰写审阅与编辑，监督，项目管理，经费获取。

利益冲突声明

作者声明不存在已知可能影响本论文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

我们 gratefully 感谢新疆医科大学高层次人才启动项目、国家研究创新人才培养项目（编号：XYD2024GR03）以及天山人才计划（2023TSYCCX0069）的资助。

宗成张|宇王|菲菲王|宇树李|李军马|健孙

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