基于四嗪的AIE探针用于超氧阴离子的特异性检测

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Tetrazine-based AIE probes for specific detection of superoxide anion

　　

摘要

结合四嗪的单电子识别特性与聚集诱导发射（AIE），理性设计并合成了两种名为 SWJT-48 和 SWJT-49 的荧光探针。该分子设计依赖于特异性还原识别机制以消除各种物质的干扰。两种探针均表现出对超氧阴离子（O₂^•?）的快速响应、高灵敏度和优异选择性。使用 SWJT-49 成功检测到了 HeLa 细胞中外源性和内源性的 O₂^•?。此外，SWJT-49 通过模拟脑缺血再灌注损伤（CIRI）的氧糖剥夺（OGD）模型，实现了 HT22 细胞中 O₂^•? 的荧光成像。该设计有效消除了传统荧光探针中因聚集和粘度变化常见的假阳性信号，同时最小化了由非特异性 AIE 聚集体背景干扰引起的假阴性信号。

引言

活性氧（ROS）是氧化应激下产生的关键生物分子，作为组织损伤和细胞凋亡的关键介导因子 [1], [2], [3]。O₂^•? 是内源性 ROS 的主要形式，在细胞信号转导、免疫防御和代谢调节中起着关键作用 [4], [5]。O₂^•? 的异常产生和积累与各种病理紊乱密切相关，如神经退行性疾病、炎症、缺血再灌注损伤和癌症 [6], [7]。CIRI 是一种常见的神经损伤，会对神经系统造成严重损害 [8], [9], [10], [11], [12]。再灌注可触发细胞内过量的 ROS 生成，并进一步导致细胞损伤和凋亡 [13]。O₂^•? 是主要致病因子和其他 ROS 的主要来源。因此，它被认为是评估 CIRI 进展的重要生物标志物 [14], [15]。因此，O₂^•? 的高灵敏度和特异性检测方法对于揭示 CIRI 的分子机制并支持有效治疗策略的开发至关重要。

过去几十年中，多种检测方法如电子自旋共振自旋捕获、电化学传感、分光光度法、化学发光和荧光成像，已被应用于检测 O₂^•? [16], [17], [18], [19], [20], [21]。在这些分析技术中，荧光成像因其操作简便、响应快速、高时空分辨率以及在体内成像方面的优异性能，已成为 O₂^•? 检测的主流工具 [22], [23], [24], [25]。如表 S1 所示 [26], [27], [28], [29], [30], [31], [32], [33], [34]，大多数报道的 O₂^•? 荧光探针是基于 O₂^•? 的亲核性或可氧化性设计的。然而，当这些探针应用于复杂的 CIRI 病理模型时，传统探针表现出一定的局限性。一方面，生物系统中各种共存物质具有与 O₂^•? 相似的亲核性或氧化性，这可能导致交叉干扰并造成相对较差的选择性。另一方面，传统探针倾向于在生理高水环境中遭受聚集导致猝灭（ACQ），从而可能产生假阴性信号。尽管 AIE 策略为解决 ACQ 问题提供了新见解，但先前的经典研究 [37], [38] 指出，AIE 探针的发光行为与先前报道的固态发光、沉淀触发和粘度敏感荧光探针相似。尽管 AIE 探针能够在聚集态实现增强的荧光亮度，但它们在实际应用中仍面临挑战，例如由微环境粘度变化引起的信号干扰以及由聚集和沉淀导致的不均匀探针分布。这种由微环境波动产生的意外信号会干扰定量准确性并降低检测可靠性。为了解决由聚集 - 沉淀和粘度干扰引起的假阳性问题，本研究开发了一种新颖的反应模式，旨在有效避免这两类意外信号。

在此，基于我们之前的荧光探针工作 [39], [40], [41], [42]，使用三苯胺和四苯基乙烯作为分子骨架，四嗪作为特异性识别单元，设计并合成了两种“开启型”荧光探针 SWJT-48 和 SWJT-49。不同于常规 AIE 系统其荧光受物理聚集或粘度变化调节，本工作利用四嗪化学还原反应作为唯一的荧光开关。探针在生理环境中保持荧光猝灭状态，无论聚集或微环境粘度波动，荧光仅在 O₂^•? 特异性识别和还原时精准开启。这种基于反应的反应机制有效避免了物理聚集和微环境粘度对信号解释的潜在干扰。在保留 AIE 骨架高亮度优势的同时，显著提高了成像精度和环境适应性。优化的探针 SWJT-49 成功实现了活细胞中外源性和内源性 O₂^•? 的可视化，并在神经元 OGD 损伤模型中实现了 O₂^•? 的原位荧光成像，为 CIRI 相关氧化应激研究提供了可靠的检测工具。

章节片段

材料与仪器

所有实验材料、仪器、荧光测量程序、细胞培养方案及细胞活力测定均列于支持信息（SI）中。合成路线如图 S1 所示，SWJT-48 和 SWJT-49 的 ¹H NMR 和 ¹³C NMR 谱图分别如图 S2-S5 所示。这两种探针相应的 ESI-MS 谱图见 Fig. S6-S7。它们相应的高分辨率质谱图见 Fig. S8-S9。

探针合成

…的合成

SWJT-48 和 SWJT-49 的设计与机理研究

大多数报道的荧光探针是基于 O₂^•? 的亲核性设计的。然而，ONOO^? 和 •NO 也表现出类似的亲核性，这可能在检测过程中造成相当大的干扰。尽管一些探针是基于 O₂^•? 的可氧化性构建的，即电子转移 [35] 或循环氧化还原机制 [36]，但它们往往面临反应动力学缓慢或热力学平衡不利等固有局限性。相比之下，如图所示

结论

总之，本研究成功开发了两种荧光探针 SWJT-48 和 SWJT-49，基于四嗪特异性单电子还原识别机制与 AIE 分子骨架的有机整合。该设计利用 O₂^•? 对四嗪单元的特异性还原作为唯一的荧光开关，有效避免了传统 AIE 系统中由物理聚集或微环境粘度波动引起的信号干扰。它显著

利益冲突声明

作者声明他们没有任何已知的可能影响本文报告工作的竞争财务利益或个人关系。

致谢

本工作受国家自然科学基金（编号：22406153）和中央高校基本科研业务费（编号：2682026ZTPY023 和 2682026CX033）支持，由中华人民共和国教育部资助。我们也感谢四川省科技厅（2025ZNSFC0946 和 2026NSFSC0888）。我们要感谢西南交通大学分析测试中心的激光共聚焦显微镜测试。

傅琴|戚瑞玲|丰宇安|苏玉斌|谭锐|赵金文|郑剑峰|彭宇|王亚文

西南交通大学化学学院，生命科学与工程学院，中国成都 610031