负载LL37多肽的双径结构TiO?纳米管涂层用于增强抗菌活性及成骨能力

《Surfaces and Interfaces》：Dual-diameter-structured TiO 2 nanotube coating loaded with LL37 peptide for enhanced antibacterial activity and osteogenesis

　　# 引言植入体相关感染是一种主要的术后并发症，显著破坏骨再生并降低植入体成功率 [1,2]。钛 (Ti) 及其合金由于其出色的可加工性、良好的承载能力和显著的生物相容性，是极具吸引力的骨科植入材料 [3,4]。然而，固态钛的生物惰性导致应力屏蔽、骨整合差和抗菌活性低效，这在感染性骨缺损修复中仍然是一个挑战 [5]。因此，增强基于钛的植入体的抗菌和成骨特性具有重要的科学和临床意义。一种有效降低细菌感染风险的策略是促进宿主细胞在植入体表面的快速覆盖，从而促进新骨形成并加速植入体 - 宿主组织整合 [1,6]。与实心钛相比，通过选择性激光熔化 (SLM) 制造的多孔钛 (pTi) 提供了可调节的杨氏模量，有效缓解了应力屏蔽 [7,8]。此外，pTi 的互连多孔结构提供了开放空间和凹曲率，能够实现高效的营养 - 废物交换，并促进细胞快速向内迁移、细胞增殖和骨再生 [8,9]。然而，仍存在着由血源性扩散或周围骨组织中的细菌潜伏引起的围手术期、潜伏性或难治性感染的风险 [10,11]。一旦感染，立即进行杀菌干预至关重要 [8]。关键的是，pTi 的增大表面面积提高了表面生物功能化的效率，能够负载和递送抗菌药物以减少植入体相关感染。实际上，在过去的几十年里，使用抗生素的抗菌治疗已经从全身给药显著转变为局部递送 [[12], [13], [14]]。然而，抗生素滥用经常引起耐药菌问题，使感染治疗复杂化 [6,15]。天然/合成抗菌肽 (AMPs) 具有广谱抗菌活性和低免疫原性，是有效对抗细菌入侵的有吸引力的替代方案 [6,16,17]。其中，人 cathelicidin 肽 LL37 表现出多效性功能，包括杀菌、招募干细胞进行成骨和加速骨愈合 [[17], [18], [19], [20]]。用 LL37 肽修饰支架以增强抗菌活性而不损害成骨是一个很有前景的策略。然而，AMP 的细胞毒性和抗菌性是剂量依赖性的，高剂量可能导致优异的抗菌活性，但可能同时损害生物功能 [21]。在局部药物递送的情况下，需要赋予植入体一个突释阶段以减少术后感染，以及一个持续缓释阶段以进行成骨。具有独特空心结构的阳极氧化 TiO? 纳米管 (TNTs) 被广泛用作药物递送系统以减轻植入体相关感染 [14,22,23]。然而，由于纳米管中的药物释放通常在接触生理溶液时开始 [14,24]，单一直径 TNTs 可能由于不希望的突释而导致细胞毒性和药物过早耗尽。尽管大直径纳米管提供了更大的体积来捕获药物以实现高剂量负载，但药物释放是不可控的 [24]。定制具有较小直径或增加长度的 TNTs 可以实现可控的负载能力和药物释放特性 [22,[24], [25], [26]]，这使得纳米管结构设计成为一种调节抗菌和成骨能力的缓解策略 [14]。在开发的多种几何形状中，之前在实心 Ti 上制备了优化的双直径 TiO? 纳米管结构，证明了 ponericin G1 的可控释放 [22]。然而，ponericin G1 是一种源自掠食性蚂蚁 Pachycondyla goeldii 的抗菌肽，表现出强效的抗菌活性，但缺乏非抗菌生物功能 [27,28]。关键在于，纳米管结构对细胞行为的积极影响不足以弥补 ponericin G1 产生的高细胞毒性 [22]。因此，需要一种关键的疗效权衡，即在抗菌疗效的同时最小化对成骨活性的损害。尽管已在 pTi 上开发了贻贝启发的双直径 TiO? 纳米管涂层 [29]，但纳米管直径与多孔钛固有微孔对药物负载和可控释放的联合作用仍未被探索。基于上述考量，预计结合微结构 (pTi 孔隙) 和纳米结构 (双直径纳米管) 负载 AMP 可以实现有效抗菌和成骨分化的协同效果。在本工作中，通过对 pTi 进行双直径纳米管涂层表面功能化，设计了一种分级结构微纳米支架，以负载多效性 AMP LL37 (序列：LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES-NH?)。研究了负载 LL37 的支架的负载效率和释放动力学、针对 S. aureus 和 E. coli 的抗菌活性，以及 in vitro 成骨活性。# 章节摘要## 材料与方法首先，通过改进的阳极氧化在多孔钛 (pTi) 支架上制备了排列良好的 TiO? 纳米管阵列。随后，通过真空辅助物理吸附方法将抗菌肽 LL37 负载到纳米管结构基底上。系统评估了功能化支架中 LL37 的体外释放动力学。评估了负载 LL37 的样品针对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌 (S. aureus, ## 多孔钛上单/双直径纳米管的形成与形貌图 1 显示了多孔钛 (pTi) 上纳米管结构的 SEM 和 TEM 图像。所有纳米管排列整齐，表面开放。在 S115 组中，纳米管表现出单一直径结构，直径约为 115 nm，长度约为 10 μm。相比之下，D30 和 D60 表现出双直径架构，由上层纳米帽与下层纳米储层互连组成。纳米帽 (长度：2 μm) 的外径为 31 ± 3 nm (D30) 和 60 ± 5 nm (D60), ## 结论在本研究中，通过改进的阳极氧化在 pTi 上获得了双直径 TiO? 纳米管，用于 LL37 肽的高储存和可控释放。双直径纳米管排列整齐，结构上由上层纳米帽 (30 和 60 nm 直径管) 互连下层纳米储层 (115 nm 直径管) 组成。得益于分级结构，双/单直径纳米管修饰 pTi 中 LL37 肽的负载效率达到 90%，无 ## CRediT 作者贡献声明**Wenhui Zhang:** 写作 – 初稿，验证，数据管理。**Na Sun:** 验证，调查，数据管理。**Fangfang Hu:** 调查。**Qian Gao:** 调查。**Caiyun Zheng:** 调查。**Xianglong Wu:** 调查。**Yanni Zhang:** 写作 – 审阅与编辑，写作 – 初稿，监督。**Tingli Lu:** 监督，概念化。## 利益冲突声明作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系，这些可能会影响本文中报告的工作。## 致谢我们感谢国家自然科学基金委 (项目编号：51801158)、陕西省自然科学基金 (项目编号：2023-JC-YB-290, 2024JC-YBMS-657) 的财政支持。我们还感谢“生命科学与技术中心实验室”、“教育部生物诊断、治疗和保护技术与装备工程研究中心”，以及“西北工业大学分析与测试中心张文辉 | 孙娜 | 胡芳芳 | 高倩 | 郑彩云 | 吴祥龙 | 张亚妮 | 陆庭利