基于多价适配体的荧光DNA纳米结构构建用于无标记荧光生物传感器

《Talanta》：Construction of multivalent aptamer-based fluorogenic DNA nanostructures for label-free fluorescent biosensors

　　

摘要

荧光点亮适配体（Fluorescent light-up aptamers, FLAPs）因其无标记荧光特性和可编程性而成为极具吸引力的信号工具。然而，基于DNA的FLAP传感器通常受限于荧光激活效率低、内在靶标响应性有限以及信号放大不足。本研究中，我们将基于DNA的FLAP（DAP）与三臂DNA（three-branched DNA, TBD）支架相结合，构建了一种多元价FLAP纳米结构（DAP–TBD），该结构对阿黎芬O（Auramine O, AO）表现出增强的荧光激活能力。与单价DAP相比，三价DAP–TBD的荧光激活效率提高了3.3倍，表明其存在明显的多元价效应。该系统采用模块化架构，其中DAP充当可替换的FLAP模型。通过由三条理性设计的发卡DNA构成的靶标触发的催化DNA组装（catalytic DNA assembly, CDA）电路，可在等温条件下组装多个DAP–TBD纳米结构，从而实现无需标记探针的靶标触发信号产生与放大。基于CDA的DAP–TBD系统可选择性检测靶标单链DNA，检测限为235 pM。此外，将DAP–TBD系统与外切酶辅助发卡及适配酶偶联，实现了microRNA和腺苷三磷酸（ATP）的无标记检测，展示了该系统作为可对接多样上游换能模块的信号传感器的通用性。该系统无需荧光团或淬灭基团标记，仅需三条未修饰的DNA链，具有可编程性、模块化与成本效益优势。总体而言，本研究提出了一种多元价基于DNA的FLAP纳米结构，并为开发无标记荧光生物传感器提供了通用策略。

引言

荧光点亮适配体（FLAPs）是具有明确二级结构的RNA或DNA寡核苷酸功能分子，通常被描述为染料结合位点或结合口袋 [1]，[2]，[3]。FLAP可通过非共价方式与其同源染料配体结合，形成FLAP–染料复合物，从而抑制非辐射能量耗散，在光激发时产生增强的荧光发射 [2]，[4]。由于FLAP消除了荧光团和淬灭基团标记的需要并显著降低了背景荧光，它们被广泛认为是传统化学修饰核酸探针的理想替代方案 [5]，[6]。目前已开发出多种FLAP，包括知名的Mango、Paper和Lettuce等，可作为有效的信号报告分子用于无标记细胞成像、分子诊断和生物传感应用，展现出显著的便利性和成本效益 [7]，[8]，[9]。尽管取得了这些进展，现有的基于FLAP的传感器仍存在若干局限，有待进一步研究 [10]，[11]，[12]。首先，与传统适配体类似，FLAP通常表现出相对较弱的结合亲和力，导致荧光强度较低，检测敏感度和测量精度下降。其次，常见的FLAP缺乏对靶标分析物的内在响应性，因此需要额外的靶标响应元件。例如，核糖开关型FLAP系统提供内在靶标响应性，但设计往往较为复杂且需要耗时的筛选。此外，目前报道的大多数基于FLAP的传感器依赖结构脆弱的RNA分子，通常需要复杂的转录系统，从而限制了其潜在应用。因此，研究人员有兴趣开发荧光输出增强、具备内在靶标响应性且能高效信号放大的基于DNA的FLAP系统，从而促进简单、低成本且高灵敏生物传感平台的构建。

为克服非共价相互作用的低亲和力，天然生物分子常表现出多元价策略，如四价血红蛋白和多元价抗体，以增强配体与受体之间的结合avidity [13]，[14]。受这些自然机制启发，人们探索了具有超结构或超分子构型的一系列人工生物分子结构，以提升其功能 [15]，[16]。这些人工结构常利用不同的纳米材料（如金纳米颗粒、金属-有机框架和核酸纳米结构）作为中心支架，以锚定多个活性生物分子单元，从而产生多元价效应 [17]，[18]，[19]。特别是，多元价功能核酸（functional nucleic acids, FNA，包括适配体和DNAzyme）已被开发为构建高性能生物传感器的功能分子器件 [20]，[21]。其中，全DNA型FNA纳米结构——由多种基于DNA的纳米级结构工程化构建——因其高均一性、丰富的锚定位点、可控性以及相对简单的制备方式而受到越来越多的关注 [22]。例如，分支DNA连接点以及四面体DNA型适配体或DNAzyme已被报道可显著提高靶标识别、信号转导和放大效率 [23]，[24]。尽管取得这些进展，多元价FLAP系统的开发仍面临挑战。大多数FLAP基于结构脆弱的RNA分子，将其整合入DNA纳米结构在技术上颇具难度。然而，最近的研究进展催生了多种基于DNA的FLAP，包括GM、Lettuce和DAP [25]，[26]，[27]，[28]。这些系统保留了RNA型FLAP的诸多优势特性，同时提供了更优的结构稳定性。因此，在DNA纳米结构上设计与构建多元价FLAP已越来越可行，有望提升荧光与生物传感性能。

在各种几何结构明确的人工DNA结构中，三臂DNA（three-branched DNA, TBD）纳米结构被认为是设计和构建人工分子器件的理想支架。其多臂结构和简单的三维几何构型便于功能模块的附着 [29]，[30]。值得注意的是，催化DNA组装（catalytic DNA assembly, CDA）已被开发为一种等温且高效的方法，用于生产基于TBD的组装产物 [31]，[32]。特别是，靶标触发的CDA系统可特异性识别输入靶标分子，并高效地将其转导为大量的TBD组装产物作为输出产物。这一能力支持构建用于高性能生物传感应用的高效信号转导器和放大器。典型的CDA系统由多条精心设计的发卡DNA链组成，通过由特定引发剂触发的一系列杂交和链置换反应，组装成热力学有利的双链结构。值得注意的是，CDA中的链置换可将从发卡DNA双链区特定的序列模块重排至TBD构建体末端处于单链区的位置。基于这种重排机制，CDA系统已被用于控制DNA探针中荧光团与淬灭基团之间的空间位置与距离，从而实现基于TBD传感器中的信号开关 [33]，[34]。这些进展表明，靶标触发的CDA也可催化FLAP型TBD纳米结构的组装，当模块化FLAP元件从发卡DNA构建体内部被精确重排时可实现信号开关与放大。

受上述进展启发，我们开发出一种纳米结构荧光点亮DNA（DAP–TBD），通过重组DAP——针对染料分子阿黎芬O（AO）的DNA适配体——与TBD支架，以改善FLAP的荧光特性。所得多元价DAP–TBD含有三个平行的DAP染料结合口袋，与单价对应物相比，其对AO的荧光激活显著增强，凸显了多元价设计的协同优势。该系统采用模块化架构，其中功能序列模块编码于DNA链内，使DAP成为可替换的模型FLAP，便于在需要时直接替换为其他FLAP。此外，分支型DAP–TBD纳米结构可通过靶标触发的CDA反应进行催化组装，其中引发剂驱动三条理性设计的发卡DNA链（H1、H2和H3）之间的交叉杂交，产生多个DAP–TBD。该过程可实现无标记的靶标触发信号产生与放大。DAP–TBD系统仅由三条未修饰的DNA链组成，既可编程又具成本效益。它可便捷地与上游换能模块（如外切酶辅助发卡或适配酶）整合，以检测多样的非核酸靶标。总之，这一设计为工程化构建用于无标记生物传感的FLAP型信号工具提供了通用且可灵活适配的策略。

章节节选

化学试剂与材料

寡核苷酸购自上海生工生物工程有限公司（中国上海），其序列见表格S1（支持性信息）。阿黎芬O（AO）和腺苷三磷酸（ATP）购自上海阿拉丁生物科技股份有限公司（中国上海）。四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸铵（APS）、丙烯酰胺（29:1，40%）以及聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的上样缓冲液购自百恩生物（Beyotime）

DAP–TBD的设计原理

基于FLAP的荧光点亮DAP–TBD纳米结构的设计原理如图1所示。这种多元价DAP–TBD由TBD支架和三个染料结合位点组成，二者共同增强了荧光点亮活性。此前报道的一种分类型DAP（基于DNA的FLAP，以下简称为sDAP）因其出色的荧光点亮性能而被选作染料结合口袋模块 [2]，[35]。sDAP在G19处含有一明确的分隔位点，将染料结合口袋切割为

结论

本研究通过将DAP与TBD支架整合，成功构建了一种多元价荧光点亮DNA纳米结构（DAP–TBD）。与单价DAP相比，三价DAP–TBD对AO的荧光激活效率提高了3.3倍，表明其存在明显的多元价效应，从而增强了荧光激活。S链与H链的模块化序列设计提供了相当高的灵活性，使DAP可作为模型FLAP被便捷地

CRediT作者贡献声明

张尧（Yao Zhang）：撰写—初稿，调查研究，数据整理，概念构思。刘潇（Xiao Liu）：研究方法，调查研究，形式化分析，数据整理。马宏亮（Hongliang Ma）：可视化，数据整理。严亮亮（Liangliang Yan）：可视化，数据整理。薛阳（Yang Xue）：形式化分析，数据整理。石少明（Shaoming Shi）：研究方法。杜杰（Jie Du）：撰写—审阅与编辑，验证，指导，资源，项目管理，经费获取，概念构思

利益冲突

我们无事项需声明。

数据可用性声明

支持本文的数据包含在补充材料中。

资金来源

本研究由中国国家自然科学基金［资助编号 22164018］、甘肃省自然科学基金［资助编号 25JRRA005］及甘肃省高等教育产业支持计划［资助编号 2026CYZC-016］资助。

利益冲突声明

? 作者声明，他们不存在任何可能被认为会影响本文所述工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

张尧|刘潇|马宏亮|严亮亮|薛阳|石少明|杜杰

西北师范大学生命科学学院，中国甘肃兰州 730070