《Nature Communications》：DNA methylation profiling identifies long-range epigenetic silencing of clustered protocadherins as a key determinant of meningioma progression
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脑膜瘤是成人中最常见的原发性脑肿瘤。然而，发生在部分脑膜瘤中的进展的分子驱动因素目前知之甚少。研究人员假设表观基因组变异是脑膜瘤临床异质性的原因，并可能与疾病进展具有功能相关性。为验证这一假设，研究人员对人类脑膜瘤的大型横断面队列和纵向队列进行了整体DNA甲基
脑膜瘤是成人中最常见的原发性脑肿瘤。然而，发生在部分脑膜瘤中的进展的分子驱动因素目前知之甚少。研究人员假设表观基因组变异是脑膜瘤临床异质性的原因，并可能与疾病进展具有功能相关性。为验证这一假设，研究人员对人类脑膜瘤的大型横断面队列和纵向队列进行了整体DNA甲基化谱分析。分析鉴定出一个与临床结局相关的DNA高甲基化特征，且该特征相比以往的分类系统能够实现对脑膜瘤更准确的预后判断。对纵向高级别脑膜瘤样本与临床良性脑膜瘤及正常脑膜组织的比较分析显示，拷贝数变异（copy number variations，CNVs）和DNA高甲基化在脑膜瘤进展轨迹中具有趋同的贡献但不同的可塑性。对高级别脑膜瘤中DNA高甲基化的系统性分析揭示了成簇原钙粘蛋白通过限制β-catenin核转位发挥肿瘤抑制作用，这与核β-catenin染色与脑膜瘤进展之间的关联一致。综上，该研究为临床良性及侵袭性脑膜瘤异质性以及疾病进展过程中的微进化适应的潜在分子机制提供了基础性见解。
**论文解读：DNA甲基化谱揭示成簇原钙粘蛋白长程表观遗传沉默驱动脑膜瘤进展**
**研究背景与问题**
脑膜瘤是成人最常见的原发性颅内肿瘤，约占所有原发性颅内肿瘤的40%。虽然大多数脑膜瘤可通过单纯手术切除治愈，但约20%的病例表现出侵袭性临床行为并具有复发倾向，需要术后辅助治疗。当前临床实践中，脑膜瘤主要依据组织病理学特征进行CNS WHO分级（1-3级），2021年WHO中枢神经系统肿瘤分类整合了组织学亚型、脑侵袭、核分裂活性、坏死等组织学特征及特定分子改变。然而，相同组织学诊断和相同CNS WHO分级的脑膜瘤患者可能表现出显著异质的疾病轨迹，凸显了单纯基于形态学分级的局限性。尽管NF2是脑膜瘤中最常见的基因改变，但高级别脑膜瘤中除NF2外尚未发现复发性编码突变，可靶向的分子改变数量也较少。以往研究表明，DNA甲基化谱单独或联合基因表达及CNV数据可提供比CNS WHO分级更准确的预后判断，但不同甲基化模式是仅仅反映分子组内谱系或发育相关过程的残留，还是DNA甲基化变化对脑膜瘤进展具有功能相关性，仍不清楚。基于此，研究人员开展了本研究，旨在系统探究DNA甲基化改变在脑膜瘤进展中的作用机制及其临床意义。该论文发表在《Nature Communications》。
**主要技术方法**
研究人员使用了以下关键技术方法：（1）采用Illumina MethylationEPIC v2.0芯片对来自德国蒂宾根大学医院（University Hospital Tübingen）的231例脑膜瘤样本（发现队列，含158例原发和73例复发样本）进行全基因组DNA甲基化谱分析，并使用SeSAMe流程控制CNVs对β甲基化值的影响；（2）利用公开可用的CNS肿瘤分类器及基于既往文献构建的支持向量机分类器预测分子分组，计算整合风险评分；（3）使用conumee2软件包从甲基化阵列数据推导CNV谱；（4）利用slingshot包进行轨迹推断分析，整合正常脑膜组织及良性脑膜瘤样本；（5）对独立公开队列（UCSF队列，565例脑膜瘤）进行验证；（6）建立包含18例原发及患者匹配首次复发（其中6例另有第二次复发）的纵向队列；（7）对培养细胞系进行基因过表达、流式细胞术、共聚焦显微镜及Western blot等细胞生物学功能实验；（8）利用组织微阵列（TMA）进行免疫组织化学（IHC）染色。
**研究结果**
**1. DNA高甲基化特征是脑膜瘤进展的基础，且独立于分子分组**
研究人员对发现队列进行主成分分析（PCA），发现PC1（占总方差的21.1%）与脑膜瘤进展风险分组最相关，沿PC1可清晰区分低风险、中风险和高风险脑膜瘤。基于贡献PC1的前1000个探针进行无监督分层聚类，将脑膜瘤分为两个不同聚类：低甲基化聚类（METHlow，n=180）和高甲基化聚类（METHhigh，n=51）。低风险肿瘤（CNS WHO 1级、NF2野生型/免疫原性、低整合风险评分）优先分配至METHlow聚类，而高风险肿瘤（CNS WHO 3级、增殖型、高整合风险）优先分配至METHhigh聚类。在UCSF独立验证队列中，所有预后良好的NF2野生型/免疫原性脑膜瘤均被分类为METHlow。Kaplan-Meier曲线分析显示甲基化聚类可显著区分无进展生存期（PFS），且在多因素Cox比例风险回归模型中独立显著（HR=2.17；95% CI，1.34-3.46；P=0.001485）。甲基化聚类成功将CNS WHO 2级病例分为不同风险组。连续甲基化聚类特征（定义为聚类定义探针的平均甲基化）经限制性三次样条建模显示与进展风险呈连续非线性关系。与现有CNS WHO分级相比，该特征在单因素和多因素分析中均显示出 improved discrimination and reclassification（改进的区分度和重分类能力），Brier评分显示连续特征在整个队列中比分子分组具有更好的校准度和更准确的绝对风险估计（ΔInt_Brier=0.008，P=5.15×10??）。
**2. CNVs与甲基化聚类特征对脑膜瘤进展具有独立但趋同的贡献**
研究人员全面分析了发现队列中的CNV景观，发现METHhigh样本中CNV发生率高于METHlow，这与UCSF队列数据一致。基因组不稳定单独或特定染色体臂CNV不足以定义METHhigh样本，8.9%的METHlow肿瘤超过了METHhigh肿瘤的基因组不稳定中位数。1p染色体缺失是整体基因组不稳定性的最佳预测因子。多因素分析中，1p缺失与疾病进展显著相关，且是METHhigh肿瘤中最普遍的染色体畸变。按甲基化聚类和1p状态联合分层发现，METHlow伴1p缺失的脑膜瘤进展显著快于1p完整的METHlow脑膜瘤；而METHhigh伴1p缺失的肿瘤（占该聚类94%）比所有其他1p缺失肿瘤具有显著更高的复发风险。分子分组无法对1p缺失脑膜瘤进行类似分层。这些数据表明METHhigh肿瘤中的DNA高甲基化是脑膜瘤进展的独立介质，可对1p改变的脑膜瘤进行进一步预后亚分层。
**3. CNVs与DNA甲基化塑造脑膜瘤进展的进化轨迹**
研究人员利用纵向队列（18例原发及患者匹配的首次复发，其中6例提供第二次复发样本）并结合正常脑膜组织及经10年PFS里程碑阈值定义的良性脑膜瘤对照，分析了脑膜瘤进展轨迹中的分子变化。无进展的原发脑膜瘤基因组稳定，无重大广谱染色体畸变；而复发性脑膜瘤在原发和复发时均显示广泛的广谱CNVs，导致更大的基因组不稳定性和更多不利CNVs。广谱CNV类型在原发与复发之间大体相似，但影响癌症驱动基因的局灶性CNVs存在显著异质性，原发和复发肿瘤中各具独特畸变，包括MDM2基因扩增以及VHL和CDKN2A/B肿瘤抑制基因缺失。在DNA甲基化层面，正常脑膜和良性脑膜瘤中甲基化聚类相关CpG位点呈显著低甲基化，而恶性脑膜瘤以显著高甲基化为特征（F(5, 35.25)=12.72，P=4.27×10??）。全局甲基化模式的主要变异来源（39.5%）将正常脑膜与所有脑膜瘤分开，提示脑膜瘤发生过程中存在独立于良恶性生物学的大规模共同甲基化改变。轨迹推断分析以正常脑膜为起点，发现良性脑膜瘤位于轨迹早期阶段，与正常脑膜样本重叠；进展性原发肿瘤及其复发位于轨迹下游，且根据甲基化聚类分配清晰分离。
**4. 成簇原钙粘蛋白的长程表观遗传沉默驱动脑膜瘤进展**
研究人员鉴定了METHhigh与METHlow样本之间的差异甲基化CpG位点，发现93%的差异甲基化探针在METHhigh样本中呈高甲基化。共鉴定出23个和744个分别显示低甲基化或高甲基化CpG位点显著富集的基因，其中HOX基因和原钙粘蛋白簇显著富集。RNA测序及UCSF队列验证显示，多数高甲基化基因未表现表达变化，但PITX1等同源盒转录因子在METHhigh肿瘤中显著上调，而PCDHGC3、PCDHB12等原钙粘蛋白显著下调。PCDHGC3仅第一外显子在METHhigh聚类中显著高甲基化，而共享恒定外显子但具有替代第一外显子的C亚家族成员PCDHGC4和PCDHGC5在METHhigh和METHlow中均显示高甲基化，提示DNA甲基化的基因组背景可能差异性地影响脑膜瘤中的转录调控。功能实验显示，源自良性脑膜瘤的细胞系（HBL-52、BEN-MEN-1）胞质中β-catenin蛋白水平显著高于核内，而源自高级别脑膜瘤的细胞系（NCH93、IOMM-Lee、KT21-MG1）显示β-catenin优先定位于核内。在恶性IOMM-Lee细胞中过表达PCDHGC3后，β-catenin显著转位至胞质，总β-catenin水平显著降低（P<2.2×10?1?），核质比显著降低（P=5.97×10?1?）。对发现队列80例METHlow和49例METHhigh脑膜瘤的组织微阵列IHC分析显示，METHlow肿瘤平均5.1%细胞核阳性，而METHhigh肿瘤平均11.4%细胞核阳性（P=0.04557）。在包含529例脑膜瘤的独立TMA队列中，核β-catenin阳性细胞比例高的脑膜瘤PFS显著较差。
**讨论与结论总结**
讨论部分指出，该研究提供了与脑膜瘤患者不良临床结局密切相关的DNA甲基化特征的证据，该特征以二分类聚类方案将脑膜瘤分为METHlow和METHhigh，二分类聚类是潜在甲基化梯度的替代指标，该梯度直接与连续的非线性风险梯度相关。对于临床病程异质性较大的分类（CNS WHO 2级、高代谢型、中危整合风险），甲基化聚类分配更均衡，但受限于样本量。研究人员发现CNVs在脑膜瘤进展过程中具有高度可塑性，而细胞遗传学和DNA甲基化共同将恶性脑膜瘤与正常脑膜及临床良性脑膜瘤区分开来。在机制层面，原钙粘蛋白（尤其PCDHG@基因簇成员）在METHhigh脑膜瘤中高甲基化并伴随表达下调，过表达PCDHGC3可阻止β-catenin核转位，而核β-catenin高染色与不良临床结局相关。研究结论认为，DNA甲基化特征定义了一个具有预后价值的连续非线性风险梯度，对于CNS WHO 2级脑膜瘤的预后判断尤其具有临床应用价值，建议对预后不明确的脑膜瘤（包括组织学上处于临界状态的CNS WHO 1级和2级、CNS WHO 2级确认、低级别肿瘤的意外快速生长、否则良性的脑侵袭性脑膜瘤以及已知高风险组织学的肿瘤）进行基于DNA甲基化阵列的扩展分子检测，并提供了一款即用型网络应用程序（https://mmcc.neurologie.uni-tuebingen.de）用于预测脑膜瘤甲基化聚类分配和CNV分析。
