南极真菌青霉属来源的Viridicatin保护人小胶质细胞及患者来源外周免疫细胞对抗氧化应激

《Antioxidants》：Viridicatin from the Antarctic Fungus Penicillium sp. Protects Human Microglia and Patient-Derived Peripheral Immune Cells Against Oxidative Stress

　　

神经退行性疾病仍是重大的治疗挑战，氧化应激在中枢和外周免疫系统功能障碍中发挥核心作用，导致神经元丢失。来自极端环境的天然产物是尚未充分开发的神经保护剂来源。本研究从采自迪塞普申岛沉积物的南极真菌青霉属（*Penicillium* sp.）中分离得到一种喹啉类生物碱Viridicatin，并通过一维/二维核磁共振波谱和单晶X射线衍射明确确认了其结构。Viridicatin（100 μM）显著减轻了过氧化氢诱导的HMC-3人小胶质细胞细胞毒性，维持了细胞活力和线粒体膜电位。Viridicatin调节了Nrf2抗氧化信号通路，伴随下游抗氧化酶HO-1和NQO1表达增加。此外，分子对接显示其优先结合KEAP1 Kelch结构域（?8.0 kcal/mol），提示存在间接的Nrf2通路调节机制。100 ns分子动力学模拟及MM-GBSA分析支持Viridicatin–KEAP1复合物的稳定性。值得注意的是，Viridicatin挽救了来自轻度认知障碍老年人外周血单个核细胞（PBMCs）免于过氧化氢诱导的细胞死亡，弥合了体外机制证据与临床相关人细胞模型之间的差距。这是Viridicatin神经保护活性的首次报道，该南极来源生物碱成为针对年龄相关神经退行性疾病进一步临床前开发的可行候选分子。

**研究背景与科学问题**
神经退行性疾病（neurodegenerative diseases, NDs）包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病及肌萎缩侧索硬化症等，以中枢和外周神经系统进行性神经元丢失为特征，最终导致神经元功能障碍和脑萎缩。尽管各类NDs在受累脑区和病因上存在差异，但其共同细胞和分子机制中，内源性抗氧化缓冲能力的逐渐丧失被认为起主要作用。中枢神经系统（central nervous system, CNS）中的小胶质细胞作为主要吞噬细胞和唯一常驻巨噬细胞，通过监测微环境、清除碎片、吞噬病原体和受损细胞、参与炎症反应、支持神经元及修剪突触等维持CNS稳态。小胶质细胞功能障碍会加速衰老和神经退行性变，因此保护小胶质细胞成为潜在的治疗靶点。衰老可减少小胶质细胞数量和活性、改变形态并损害功能，这些过程受端粒缩短、DNA损伤和氧化应激等驱动。氧化应激与衰老及年龄相关疾病密切关联，不仅损害小胶质细胞功能并在脑内触发神经炎症反应，外周氧化易感性也被证实存在于阿尔茨海默病及其前驱阶段即轻度认知障碍（mild cognitive impairment, MCI）中，表明中枢和外周氧化还原失调共同参与疾病生物学。内源性抗氧化反应主要受转录因子Nrf2调控，正常条件下Nrf2与胞质中的KEAP1蛋白结合并被靶向降解，氧化应激或亲电试剂触发Nrf2释放、核转位并与抗氧化反应元件（antioxidant response elements, AREs）结合，激活下游基因如HO-1和NQO1等。Nrf2失调日益被认为与衰老和神经退行性疾病相关。天然产物历来是新药的重要来源，而极端环境（如南极）微生物特别是真菌呈现高度多样性和巨大的生物技术潜力。南极真菌长期暴露于低温、冻融循环、缺水、强风和高紫外线辐射等严酷条件，其中青霉属物种分布广泛且能产生多种次级代谢产物。本研究旨在从南极迪塞普申岛土壤样品中分离的青霉属真菌中鉴定一种活性分子，并评估其对抗过氧化氢（H₂O₂）诱导氧化应激的神经保护能力。

**研究内容与主要结论**
研究人员从南极迪塞普申岛（南纬62°58′28″，西经60°34′14″）采集土壤样品，经培养纯化获得一株青霉属（*Penicillium* sp.）真菌，通过PCR扩增内转录间隔区（ITS）序列并经BLAST比对完成菌种鉴定。该菌株经静态发酵培养23天后，用乙酸乙酯萃取获得总有机提取物，经硅胶柱层析分离得到单一化合物。通过一维/二维核磁共振波谱（包括1H、13C NMR以及COSY、NOESY、HSQC、HMBC）结合单晶X射线衍射明确鉴定了该化合物为Viridicatin，一种喹啉类生物碱。值得注意的是，这是Viridicatin晶体结构的首次报道，其晶体学数据已存入剑桥晶体学数据中心（CCDC 2524160）。

功能实验采用HMC-3人小胶质细胞系，研究人员首先确定了H₂O₂诱导氧化应激的优化条件（300 μM，24 h，IC₅₀约325 μM）。实验表明，Viridicatin（100 μM）预处理2 h可显著减轻H₂O₂诱导的细胞死亡，将24 h细胞死亡率从35.6%降至18.6%。JC-1染色结果显示，Viridicatin在6 h时间点维持了线粒体膜电位（ΔΨm），阻止了H₂O₂诱导的线粒体去极化。共聚焦免疫荧光和Western blot分析表明，Viridicatin单独处理可适度增加Nrf2核转位及HO-1蛋白表达，而与H₂O₂联合处理时，细胞核Nrf2水平恢复至接近对照组水平，同时胞质HO-1信号增强。RT-qPCR结果表明，Viridicatin与H₂O₂联合处理显著上调*NFE2L2*和*NQO1* mRNA表达，而*HMOX1* mRNA在H₂O₂单独处理下已显著升高。

分子对接结果显示，Viridicatin与KEAP1 Kelch结构域结合亲和力最高（?8.0 kcal/mol），通过氢键（Gly464）、碳-氢键（Val512）及烷基疏水接触（Ala366、Ala510）占据Nrf2结合口袋；与HO-1血红素腔的结合亲和力为?7.5 kcal/mol；与NQO1的结合最弱（?6.1 kcal/mol）。100 ns分子动力学模拟及MM-GBSA计算表明，Viridicatin–KEAP1复合物最为稳定（配体RMSD < 0.4 ?，ΔG_bind = ?42.74 kcal/mol），接触残基网络扩展至Val418、Val463、Val465和Ile416；Viridicatin–HO-1复合物在模拟中结合自由能改善（?52.75 kcal/mol），形成以Phe37、Phe166和Phe167为主的π-堆积替代结合模式；而Viridicatin–NQO1复合物则完全失去初始接触残基，结合自由能从?51.21 kcal/mol衰减至?33.81 kcal/mol，排除NQO1为直接靶标。

在临床相关人细胞模型中，研究人员从认知健康（CH，n = 4）和轻度认知障碍（MCI，n = 8）老年捐赠者（>60岁）外周血中分离PBMCs。MCI来源PBMCs经100 μM H₂O₂处理后活力降至约70%，Viridicatin（100 μM）预处理将其恢复至约85%；经300 μM H₂O₂处理后活力进一步降至约40%，Viridicatin仍提供约15%的保护。与之相比，CH来源PBMCs在300 μM H₂O₂攻击下活力降至约50%，而仅50 μM Viridicatin即可完全消除该细胞毒性，将活力恢复至约85%。此外，ADMET计算预测显示Viridicatin符合Lipinski等药物相似性规则，具有中等亲脂性（log P 2.70）、较小极性表面积（53.09 ?2）、可透过血脑屏障且非P-糖蛋白底物，预测毒性为4级（LD₅₀ 1000 mg/kg）。

**研究意义**
本研究首次报道了Viridicatin的神经保护活性，证明南极来源的真菌次级代谢产物可通过KEAP1–Nrf2通路间接激活内源性抗氧化防御系统，在永生化小胶质细胞和患者来源原代人外周免疫细胞中均显示出对氧化应激损伤的保护作用。该发现不仅拓展了对南极极端环境微生物天然产物生物活性的认知，也为开发针对年龄相关神经退行性疾病的候选药物提供了新的分子骨架和机制依据。

**技术方法概述**
研究采用以下关键技术方法：菌株经ITS rDNA测序鉴定（样品来源为南极迪塞普申岛沉积物）；化合物结构经1D/2D-NMR（COSY、NOESY、HSQC、HMBC）和单晶X射线衍射确定；细胞活力实时监测采用IncuCyte活细胞成像系统结合Sytox Green膜完整性探针；线粒体膜电位通过JC-1荧光比值评估；蛋白定位和表达分别通过共聚焦免疫荧光和Western blot检测；mRNA水平采用RT-qPCR分析；分子间相互作用通过AutoDock Vina分子对接、Desmond分子动力学模拟（100 ns）和MM-GBSA自由能计算预测；药物样性及ADMET性质经SwissADME、ADMETlab 3.0和ProTox-3.0在线平台评估。PBMCs分离自经标准化神经心理学评估（MoCA、MoCA-MIS、AD8、CDR-SB）分类的认知健康老年人和MCI患者的静脉血样本，细胞活力通过流式细胞术碘化丙啶（PI）排斥法测定。

**结果分述**
*3.1 Viridicatin的分离与结构鉴定*
从南极青霉属真菌静态培养物中分离得到主要次级代谢产物，经单晶X射线衍射首次确证Viridicatin晶体结构（CCDC 2524160），NMR数据支持喹啉酮骨架。

*3.2 H₂O₂诱导HMC-3小胶质细胞毒性*
H₂O₂以浓度依赖性方式显著降低HMC-3细胞活力，≥300 μM时细胞活力下降约80%，24 h IC₅₀为325 μM。

*3.3 Viridicatin减轻H₂O₂诱导的HMC-3细胞死亡*
Viridicatin（100 μM）预处理将H₂O₂诱导的24 h细胞死亡率从35.6%降至18.6%，且浓度≤100 μM时无内在细胞毒性。

*3.4 Viridicatin在氧化应激下维持HMC-3细胞线粒体膜电位*
JC-1检测显示6 h时Viridicatin处理维持红/绿荧光比值与对照组相当，阻止了H₂O₂诱导的线粒体膜电位丢失。

*3.5 Viridicatin调节Nrf2核转位*
共聚焦免疫荧光显示Viridicatin与H₂O₂联合处理使核Nrf2水平恢复至对照组水平，同时增加胞质HO-1信号，提示降低氧化负荷并促进氧化还原稳态恢复。

*3.6 Viridicatin增加HMC-3细胞Nrf2和HO-1蛋白表达*
Western blot证实Viridicatin和H₂O₂均显著增加Nrf2和HO-1蛋白丰度，NQO1蛋白在评估时间点无明显增加。

*3.7 Viridicatin调节H₂O₂暴露下HMC-3细胞抗氧化酶基因表达*
RT-qPCR显示Viridicatin与H₂O₂联合处理显著增强*NFE2L2*和*NQO1* mRNA表达，H₂O₂单独显著诱导*HMOX1*表达。

*3.8 Viridicatin以剂量和队列依赖性方式减轻患者来源PBMCs的氧化应激诱导活力丧失*
MCI供者PBMCs在100 μM H₂O₂下活力降至约70%，Viridicatin恢复至约85%；CH供者PBMCs在300 μM H₂O₂下活力约50%，50 μM Viridicatin即可完全保护至约85%。Viridicatin在无氧化应激条件下不改变基础活力。

*3.9 Viridicatin针对Nrf2调控轴的分子对接*
Viridicatin与KEAP1 Kelch结构域结合最强（?8.0 kcal/mol），通过Gly464氢键和Ala366/Ala510疏水接触占据Nrf2结合口袋，HO-1以?7.5 kcal/mol次之，NQO1最弱（?6.1 kcal/mol）。

*3.10 Viridicatin复合物的分子动力学模拟*
KEAP1复合物在100 ns内保持稳定（配体RMSD<0.4 ?，ΔG_bind = ?42.74 kcal/mol），HO-1复合物经接触残基转换获得更优结合自由能（?52.75 kcal/mol），NQO1复合物完全丢失初始接触残基且结合自由能显著衰减，排除其作为稳定直接靶标。

*3.11 Viridicatin的理化性质及ADMET特征*
Viridicatin符合Lipinski、Ghose、Veber、Egan和Muegge规则，预测具有血脑屏障渗透性、非P-糖蛋白底物、低hERG风险（0.162）和4级毒性（LD₅₀ 1000 mg/kg）。Tox21预测其在Nrf2/ARE通路（SR-ARE）无活性（0.89），支持间接激活Nrf2机制。

**讨论总结与结论**
讨论部分指出，Viridicatin属于喹啉类生物碱，此前虽已知其抗菌、抗真菌和抗氧化活性，但本研究首次报道其细胞保护活性。氧化应激导致的小胶质细胞功能障碍是NDs的重要因素，H₂O₂浓度在病理条件下可达约1 mM，体外外源性给予H₂O₂可模拟该条件。Viridicatin预处理逆转H₂O₂诱导的细胞活力降低和线粒体膜电位去极化。机制方面，H₂O₂诱导的Nrf2核积累反映强氧化应激下的适应性应答；Viridicatin与H₂O₂联合处理后核Nrf2降低并不代表抑制Nrf2信号，而是氧化负荷减轻和氧化还原稳态恢复的结果。NQO1 mRNA与蛋白在6 h时间点出现差异，可能反映转录诱导与蛋白翻译积累之间的时间延迟。PBMCs实验结果揭示MCI患者细胞对H₂O₂更敏感，而CH供者细胞仅需半剂量Viridicatin即可完全保护，提示化合物功效受靶细胞群体内在氧化还原状态调节。分子对接和MD模拟共同表明KEAP1是Viridicatin的稳定首选靶标，通过占据KEAP1 Kelch结构域的Nrf2结合口袋竞争性稳定Nrf2，在氧化损伤来临前预激活细胞抗氧化防御；HO-1可能作为次要靶标发挥非经典核转位调控作用；NQO1不是直接靶标，其表达变化通过KEAP1–Nrf2轴上游氧化还原正常化介导。Tox21预测Viridicatin对Nrf2/ARE通路无直接活性，进一步支持间接作用机制。
研究结论：南极真菌*Penicillium* sp.来源的Viridicatin通过稳定KEAP1–Nrf2界面间接激活Nrf2抗氧化通路，在HMC-3人小胶质细胞和患者来源PBMCs中表现出显著的抗氧化应激保护作用，有望成为针对年龄相关神经退行性疾病的临床前开发候选化合物。