《Cells》：MBD3 Knockdown Promotes the Differentiation of Bovine iPSCs into Primordial Germ Cell-like Cells Associated with Altered Bivalent Modification of TGF-β-Related Genes
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甲基-CpG结合域蛋白3（MBD3）是核小体重塑与去乙酰化酶（NuRD）共抑制蛋白复合物的成员，在胚胎发育、多能干细胞（PSC）分化和诱导多能干细胞（iPSC）重编程中发挥关键作用。然而，MBD3是否也参与iPSC向原始生殖细胞样细胞（PGCLCs）的分化尚不
甲基-CpG结合域蛋白3（MBD3）是核小体重塑与去乙酰化酶（NuRD）共抑制蛋白复合物的成员，在胚胎发育、多能干细胞（PSC）分化和诱导多能干细胞（iPSC）重编程中发挥关键作用。然而，MBD3是否也参与iPSC向原始生殖细胞样细胞（PGCLCs）的分化尚不清楚。在本研究中，研究人员采用单层细胞培养方法，对重编程过程中经MBD3敲低（MBD3 KD）产生的牛iPSCs进行PGCLC分化。结果表明，MBD3 KD增强了牛iPSCs分化为PGCLCs的能力。MBD3-KD牛iPSC来源的PGCLCs表现出体内处于迁移状态的原始生殖细胞（PGCs）的特征。MBD3 KD在PGCLC诱导过程中增强了NODAL信号转导，并与PRDM1和SOX15表达增加相关。此外，MBD3 KD增加了转化生长因子β（TGF-β）相关基因的双价修饰，同时伴随着牛iPSCs中DPPA4和DNMT3L表达的上调，且这种表观遗传改变与增强的NODAL信号相关。研究结果表明，重编程过程中的MBD3 KD有利于牛iPSCs向PGCLCs分化，进一步凸显了MBD3在生殖细胞发育过程中对组蛋白修饰的影响。
**论文解读：MBD3敲低通过调控TGF-β相关基因双价修饰促进牛iPSCs向原始生殖细胞样细胞分化**
**一、研究背景与问题的提出**
原始生殖细胞（primordial germ cells, PGCs）的形成是生殖系特化的第一步，也是评估多能干细胞（pluripotent stem cells, PSCs）发育潜能的重要基准。然而，PGC特化所涉及的信号通路和转录调控层级在不同物种间存在显著差异。在小鼠中，PGC命运由WNT介导的BMP4信号启动，进而激活PRDM1（BLIMP1）和PRDM14；在人类中，BMP信号上调PRDM1和TFAP2C，SOX17与PRDM1协同建立人类PGC基因表达程序。虽然牛PGC的发育过程与人类有一定相似性，但其精确的信号通路、关键转录调控因子和调控网络仍未完全阐明。因此，牛iPSCs能否高效分化为原始生殖细胞样细胞（primordial germ cell-like cells, PGCLCs）以及MBD3介导的表观遗传机制如何影响这一过程，是当前尚未解决的科学问题。
甲基-CpG结合域蛋白3（methyl-CpG binding domain protein 3, MBD3）作为核小体重塑与去乙酰化酶（nucleosome remodeling and deacetylase, NuRD）复合物的核心亚基，在早期胚胎发育中印记基因的维持、胚胎干细胞（embryonic stem cell, ESC）多能性的维持与自我更新、PSCs的分化以及iPSCs的诱导产生中均发挥重要作用。值得注意的是，MBD3/NuRD在重编程中的作用具有情境依赖性，既可作为正向调节因子也可作为负向调节因子。研究人员前期发现，MBD3敲低通过HIF1A减少DNA损伤，从而促进牛iPSCs的多能性和体外分化能力，提示MBD3缺失可能增强牛iPSCs的发育潜能。然而，MBD3敲低是否影响iPSCs向PGCLCs的分化，目前尚无报道。本研究旨在探究MBD3敲低对牛iPSCs向PGCLCs分化的影响及其表观遗传调控机制。
**二、研究内容与主要结论**
研究人员首先利用LCDM培养系统将牛胎儿成纤维细胞（bovine fetal fibroblasts, BFFs）重编程为牛iPSCs，并通过在重编程后48小时转染MBD3 siRNA获得MBD3敲低（MBD3 KD）的iPSC-siMBD3细胞，转染无义序列的iPSC-NC细胞作为对照。随后，研究人员优化并建立了一种二维（2D）单层培养的PGCLC分化方案，将iPSCs先经Activin A和CHIR99021预诱导2天形成早期中胚层样细胞（incipient mesoderm-like cells, iMeLCs），再在含BMP4、SCF、EGF和LIF的培养基中诱导分化6-8天获得PGCLCs。通过定量实时PCR（qRT-PCR）、免疫荧光染色、 bulk RNA测序（RNA-seq）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）和染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）等多种技术手段，系统研究了MBD3敲低对牛iPSCs向PGCLCs分化效率的影响及其分子机制。
研究发现，MBD3 KD显著增强了牛iPSCs分化为PGCLCs的能力。scRNA-seq分析显示，在分化第5天，iPSC-NC细胞中几乎不产生PGCLCs（仅占0.20%），而iPSC-siMBD3细胞中PGCLCs占比高达14.71%。MBD3-KD牛iPSC来源的PGCLCs表现出体内处于迁移状态的PGCs的特征，高表达基因组稳定相关基因（KRT8、RADX和CRYAB）和表观遗传修饰因子（JMJD1C和EZH2），且不表达晚期PGC或减数分裂相关标记基因。跨物种转录组比较显示，PGCLC-siMBD3细胞在转录组水平上比PGCLC-NC细胞更接近牛、山羊、猪、人和小鼠的内源PGCs。在信号通路层面，MBD3 KD增强了NODAL信号转导，且PGCLC-siMBD3细胞中PRDM1的表达由多重信号通路依赖转变为以NODAL信号为主导的调控模式。在表观遗传机制层面，ChIP-seq分析揭示MBD3 KD增加了TGF-β相关基因启动子区域的H3K4me3/H3K27me3双价修饰，这一表观遗传改变与DPPA4和DNMT3L表达上调相关，进而增强了NODAL信号的转导。
**三、关键技术与方法**
本研究主要采用了以下关键技术方法：1）基于PiggyBac转座子系统、携带牛OCT3/4、SOX2、KLF4和c-MYC四种重编程因子的BFFs重编程技术，在LCDM无饲养层培养体系中获得牛iPSCs；2）优化的二维单层培养PGCLC诱导分化方案，分为iMeLC预诱导和PGCLC诱导两个阶段；3）qRT-PCR和免疫荧光染色用于检测PGC标记基因的表达和定位；4）bulk RNA-seq和scRNA-seq用于全面解析分化过程中的转录组动态变化和细胞异质性；5）ChIP-seq用于全基因组范围内分析MBD3、H3K4me3和H3K27me3的分布；6）使用BMP受体抑制剂LDN193189、NODAL抑制剂SB431542和WNT抑制剂IWR1/XAV939进行信号通路功能验证；7）使用JNK抑制剂SP600125和HDAC1抑制剂ACY-957探究MBD3调控DPPA4和DNMT3L表达的分子机制。研究中的动物实验经内蒙古大学动物护理与使用委员会批准（批准号：IMU-MOUSE-2021-047），CD1（ICR）品系小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
**四、研究结果**
**4.1 MBD3 KD增强了牛iPSCs分化为PGCLCs的能力**
研究人员首先尝试了基于iMeLCs的3D悬浮分化方法，但发现3D方法获得牛PGCLCs的效率不高，难以满足后续机制研究的需求。随后研究人员利用2D单层培养方法成功实现了牛iPSCs向PGCLCs的定向分化。在整个分化过程的时序分析中，研究人员发现TFAP2C和SOX15在分化第3天显著上调，PRDM1在第5天显著上调，呈现TFAP2C/SOX15先诱导、PRDM1随后激活的时序特征，这与人类PGCLC分化过程相似。免疫荧光染色进一步证实，TFAP2C在预诱导阶段先在细胞质中合成，在PGCLC诱导第3天进入细胞核发挥转录因子功能；SOX15在分化第3天开始积累，第5天在PGCLC-siMBD3细胞中出现核表达，而PGCLC-NC细胞中未检测到SOX15的核定位。此外，在亚培养扩增过程中，PGCLC-siMBD3细胞能够维持TFAP2C、SOX17和SOX15等PGC标记基因的表达。
**4.2 scRNA-Seq显示MBD3 KD的牛PGCLCs更接近体内PGCs**
Bulk RNA-seq数据分析显示，PGCLC-siMBD3细胞与牛胎儿性腺中体内PGCs（CRL=4 cm）之间的差异表达基因数少于PGCLC-NC细胞与PGCs之间的数目，且PRDM1、TFAP2C、ITGA6、KIT、CXCR4、GATA3、SALL4和ALPL等关键基因的表达水平在PGCLC-siMBD3细胞中与体内牛PGCs更为相似。scRNA-seq分析鉴定出三个细胞群：表达生殖系特异基因TFAP2C、PRDM1、DPPA3和SOX15的PGCLCs群，表达TMEM88、IRX5、DCK和ACTC1的间充质样细胞（MeLCs）群，以及表达SCG3、DNER、NEFL和NEFM的神经样细胞群。iPSC-NC细胞分化产物中几乎不含PGCLCs（0.20%），而iPSC-siMBD3细胞分化产物中PGCLCs占14.71%。在iPSC-siMBD3来源的PGCLC簇中，50.37%的细胞表达PDPN，25.18%表达TFAP2C，9.74%表达PRDM1，10.49%表达SOX15，其中23个细胞（1.70%）同时共表达全部四种典型PGCLC标志物（TFAP2C+、PRDM1+、SOX15+和PDPN+）。该PGCLC簇不表达DAZL、DDX4或SYCP1/2/3等晚期PGC或减数分裂相关标记基因，符合早期PGCLC的特征。
**4.3 MBD3 KD通过增强NODAL信号促进牛PGCLCs中PRDM1和SOX15的表达**
基因集富集分析（GSEA）显示，iPSC-siMBD3细胞中TGF-β信号通路相关基因的表达显著高于iPSC-NC细胞。Western blot分析表明，在iPSC-siMBD3细胞中，WNT信号维持在低基础水平，而BMP和NODAL信号呈现协调激活状态，表现为SMAD2总蛋白和p-SMAD2磷酸化水平升高、总SMAD1/5稳定但p-SMAD1活性增强。信号通路抑制剂实验揭示，在PGCLC-NC细胞中，TFAP2C的诱导依赖于BMP和WNT信号，SOX15的诱导需要BMP和NODAL信号，而PRDM1的表达依赖于BMP、NODAL和WNT三种信号的整合活性。相比之下，在PGCLC-siMBD3细胞中，仅NODAL抑制即可消除PRDM1在终末阶段的表达，而BMP或WNT抑制则不能，表明MBD3敲低使PRDM1的调控从多信号通路依赖转变为以NODAL信号为主导的调控模式。
**4.4 MBD3 KD通过增加TGF-β相关基因的双价修饰促进牛iPSCs分化为PGCLCs**
全基因组ChIP-seq分析显示，与iPSC-NC细胞相比，iPSC-siMBD3细胞中H3K27me3的变化比H3K4me3更为显著。两株细胞系共有1339个双价修饰标记的CpG岛（CGI）相关基因，另有228个基因仅在iPSC-siMBD3细胞中检测到双价修饰。这些新增的双价修饰基因大多与TGF-β超家族相关，代表性基因包括ARL4C、BCAM、LAPTM4B和F3。MBD3敲低与PGCLC分化过程中TGF-β相关基因启动子处H3K4me3/H3K27me3双价修饰的增加相关。
**4.5 MBD3 KD通过HDAC1增加DPPA4和DNMT3L的表达以改变牛iPSCs的双价染色质修饰**
qRT-PCR和Western blot分析显示，iPSC-siMBD3细胞中DPPA4和DNMT3L的表达高于iPSC-NC细胞，而HDAC1的表达显著降低。ChIP-seq结果显示MBD3直接结合于DPPA4基因（而非DPPA2或DNMT3L），提示MBD3可直接调控DPPA4基因的表达。使用JNK抑制剂SP600125处理iPSC-NC细胞后，MBD3蛋白表达下降，进而导致HDAC1蛋白表达降低，DPPA4基因表达和DNMT3L蛋白水平升高。使用HDAC1抑制剂ACY-957处理iPSC-NC细胞同样增加了DPPA4基因表达和DNMT3L蛋白水平，证实DNMT3L与HDAC1存在功能关联。基于上述结果，研究人员提出了一个工作模型：MBD3敲低增加DPPA4和DNMT3L的表达，DPPA4结合H3K4me3标记的启动子并稳定H3K4me3水平、阻止从头DNA甲基化，DNMT3L则与PRC2复合物组分（EZH2和SUZ12）在H3K4me3标记的启动子处形成复合物，促进PRC2介导的H3K27me3建立，而DPPA4-DNMT3L协同阻止从头DNA甲基化，从而使发育相关基因的启动子以双价状态存在。
**五、总结与结论**
本研究通过建立2D单层培养的牛iPSCs向PGCLCs分化体系，首次揭示了MBD3在牛生殖系特化中的新功能。研究结论如下：MBD3敲低显著增强了牛iPSCs向PGCLCs的分化效率，并促进细胞获得迁移状态的PGC样特征；在机制层面，MBD3敲低上调NODAL信号，进而促进核心PGC调控因子PRDM1和SOX15的表达；MBD3敲低还诱导TGF-β相关基因位点的双价组蛋白修饰，并升高多能性/生殖系相关因子DPPA4和DNMT3L的表达，表明重编程过程中MBD3敲低引起的表观遗传重塑使iPSCs倾向于进入具有生殖系潜能的状态。该研究为通过靶向表观遗传调控优化牛iPSC来源的PGCLC诱导方案提供了机制基础，在畜牧育种和种质资源保存方面具有潜在应用价值。本研究论文发表于《Cells》期刊。
