《International Journal of Molecular Sciences》：Comparative Characterization of σ32-Dependent Promoters for the Heat-Inducible Expression of FAST-PETase in Escherichia coli
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重组酶表达的高效调控是开发微生物生物催化剂的重要考虑因素。由替代sigma因子σ32调控的热诱导启动子为在大肠杆菌（*Escherichia coli*）中控制基因表达提供了一种无诱导剂策略。本研究以与超折叠绿色荧光蛋白（superfolder green f
重组酶表达的高效调控是开发微生物生物催化剂的重要考虑因素。由替代sigma因子σ32调控的热诱导启动子为在大肠杆菌（*Escherichia coli*）中控制基因表达提供了一种无诱导剂策略。本研究以与超折叠绿色荧光蛋白（superfolder green fluorescent protein, sfGFP）融合的PET降解酶FAST-PETase作为模型重组蛋白，对四个σ32依赖性启动子（PdnaK、PgrpE、PibpA和PclpB）进行了comparative表征。研究人员基于基础泄漏、诱导动力学和热诱导后的表达强度评估了启动子性能。在所检出的启动子中，PdnaK表现出最强的热诱导表达，研究人员对其进行了剖析，以检验其启动子衍生元件的自主行为和组合行为。分子对接分析进一步支持了实验观察结果，预测的σ32–DNA相互作用与启动子性能之间呈现定性一致性。综上所述，这些发现提供了对σ32依赖性启动子的comparative表征，并鉴定出可能有助于在大肠杆菌中开发热诱导重组酶表达系统的启动子架构。
**摘要**
重组酶表达的高效调控是开发微生物生物催化剂的重要考量因素。由替代sigma因子σ32调控的热诱导启动子为在大肠杆菌（*Escherichia coli*）中控制基因表达提供了一种无诱导剂策略。本研究以PET降解酶FAST-PETase与超折叠绿色荧光蛋白（superfolder green fluorescent protein, sfGFP）融合作为模型重组蛋白，对四个σ32依赖性启动子（PdnaK、PgrpE、PibpA和PclpB）进行了comparative表征。研究人员基于基础泄漏、诱导动力学和热诱导后的表达强度评估了启动子性能。在所检出的启动子中，PdnaK表现出最强的热诱导表达，研究人员对其进行了剖析，以检验其启动子衍生元件的自主行为和组合行为。分子对接分析进一步支持了实验观察结果，预测的σ32–DNA相互作用与启动子性能之间呈现定性一致性。综上所述，这些发现提供了对σ32依赖性启动子的comparative表征，并鉴定出可能有助于在大肠杆菌中开发热诱导重组酶表达系统的启动子架构。
**论文解读**
**1. 引言与研究背景**
聚对苯二甲酸乙二醇酯（Polyethylene terephthalate, PET）因其化学稳定性和机械耐久性被广泛应用，但其难以生物降解的特性也造成了严重的环境问题。已有研究在人类食物链和多种生物样本中检测到PET衍生的微塑料，凸显了开发有效PET降解策略的紧迫性。酶促降解已成为PET回收的可持续策略，其中FAST-PETase作为一种经蛋白质工程改造的PET水解酶，在温和条件下表现出增强的降解性能。然而，传统依赖异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG）诱导的T7表达系统存在基础泄漏表达、代谢负担以及诱导剂成本高等问题。因此，开发替代化学诱导剂的无诱导剂诱导策略具有重要意义。
**2. 研究目的与方法**
本研究旨在系统表征大肠杆菌中四个σ32依赖性热激（Heat Shock, HS）启动子（PdnaK、PgrpE、PibpA和PclpB）在热诱导重组蛋白表达中的性能。研究人员以FAST-PETase与sfGFP融合蛋白作为模型重组蛋白，通过构建报告系统实现表达的实时监测。研究方法主要包括：将HS启动子替换T7启动子构建热诱导表达系统；通过SDS-PAGE、Western blot、GFP荧光测量等手段评估启动子的基础泄漏水平、诱导动力学和表达强度；对性能最优的PdnaK启动子进行功能解析，考察其衍生的三个启动子元件（P1、P2和P3）的独立和组合行为；利用HADDOCK分子对接分析预测σ32与各启动子元件的相互作用。本研究所用的质粒构建基于pET21b载体，宿主菌株为BL21(DE3)和BL21，具体的培养和诱导条件已在材料与方法中详述。
**3. 研究结果**
**3.1 FAST-PETase-sfGFP报告系统的验证**
通过FTIR光谱、失重分析和SEM确认了密码子优化的FAST-PETase具有催化活性。在IPTG诱导下，SDS-PAGE和Western blot分析显示在57.6 kDa处出现预期的融合蛋白条带。GFP荧光与OD600的比值（GFP/OD）随时间和IPTG浓度增加而增长，且Western blot条带强度的定量分析结果与荧光测量结果趋势一致，证实了该系统可用于监测FAST-PETase-sfGFP的相对表达水平。
**3.2 σ32依赖性启动子的comparative筛选**
在热诱导前，T7启动子构建体表现出最高的基础GFP/OD信号，而所有HS启动子均表现出极少的基础泄漏。热诱导（42°C）后，所有构建体的生长曲线相似，表明启动子选择对细胞生长没有显著影响。不同HS启动子表现出不同的诱导动力学：PgrpE显示低基础泄漏和弱表达；PibpA和PclpB表现出快速的初始诱导，但只有PibpA在全程维持较高表达；PdnaK则产生最高的表达水平和最高的诱导倍数，同时维持远低于T7启动子的基础表达，综合性能最优。
**3.3 PdnaK启动子的功能表征**
由于PdnaK表现出最强的整体性能，对其启动子衍生元件（P1、P2和P3）进行了单独和组合测试。结果显示，P1和P3单独使用均无可检测的热诱导表达；P2单独使用时表现出最高的基础GFP/OD和绝对GFP/OD，且在整个时间过程中持续增加。将P1或P3与P2组合可显著降低基础表达和绝对荧光，但维持热诱导性。所有P2组合配置的诱导倍数相当，但P2单独配置的表达随时间持续上升，而包含P1和/或P3的构建体在约2小时达到最大表达后逐渐下降。
**3.4 σ32与PdnaK启动子元件相互作用的结构解析**
序列比对显示P1、P2和P3的?35和?10区域存在序列变异。分子对接分析表明，P2启动子元件与σ32的预测相互作用最为有利（HADDOCK评分最低），而P1和P3的评分较低。这一趋势在AlphaFold和SWISS-MODEL/ChimeraX两种独立结构模型中均一致，且与实验观察到的启动子活性定性相符——P2基础表达和热诱导表达最高，而P1和P3单独无可检测活性。
**4. 讨论**
本研究发现σ32依赖性启动子不同的表达谱反映了它们在天然热休克反应中的生物学功能。PibpA和PclpB的快速但瞬时诱导与它们在早期应激反应中的功能一致；PdnaK的持续表达与DnaK伴侣系统在维持蛋白质稳态中的核心作用相符；PgrpE的弱诱导与其在DnaK调控网络中作为核苷酸交换因子和温度传感器的角色一致。PdnaK在热诱导后约2小时达到最大荧光，随后下降，这与已知的DnaK/FtsH通路对σ32的负反馈调控机制一致。P1和P3对P2基础表达的调节作用可能与σ32在胞内丰度受限有关。分子对接结果提供了结构层面的解释，但HADDOCK评分仅提供相对估算而非真实结合亲和力。热诱导系统相比IPTG系统具有无需化学诱导剂、可激活内源伴侣系统的优势，但仍需进一步研究以比较两种系统在蛋白质产量、溶解度、生产效率和可放大性方面的差异。
**5. 结论**
通过对四个天然σ32依赖性启动子的系统比较，本研究鉴定了PdnaK是大肠杆菌中热诱导FAST-PETase表达性能最优的启动子。对PdnaK启动子衍生元件的剖析表明，PdnaK2在合成报告系统架构中表现出最强的自主启动子活性，而PdnaK1和PdnaK3则调节基础表达，与预测的σ32–DNA相互作用的定性差异一致。这些发现表明，启动子架构可作为平衡热响应系统中基础泄漏和诱导表达的有效设计参数，为在大肠杆菌中工程化热诱导启动子用于重组酶表达提供了有价值的信息。
