《Plants》：Cucurbitacins in Plant–Insect Interactions: Biosynthesis, Regulation, Ecological Functions, and Prospects for Crop Protection
葫芦素是高度氧化的四环三萜类化合物，其特征是强烈的苦味、显著的结构多样性以及对植物-植食者互作的重要影响。虽然葫芦素最为人所知的是存在于葫芦科（Cucurbitaceae）植物中，但葫芦素及相关的葫芦烷型代谢产物也出现在系统发育上相距较远的草本和木本植物中。遗传学和生物化学研究已验证了若干核心生物合成步骤，包括由氧化角鲨烯环化酶（oxidosqualene cyclase）催化形成葫芦二烯醇（cucurbitadienol），以及随后由细胞色素P450单加氧酶（cytochrome P450 monooxygenase）、酰基转移酶（acyltransferase）和糖基转移酶（glycosyltransferase）介导的修饰。组织偏好性的碱性螺旋-环-螺旋（basic helix–loop–helix, bHLH）转录因子是特征最明确的调控层级，而支持辅助调控因子、转运蛋白和环境响应的证据则从功能验证到转录组学或基因组学预测不等。从植物的角度来看，葫芦素能够阻止许多广食性及非适应性植食者取食或损害其表现。相比之下，专食性的瓜叶甲类甲虫（diabroticite beetle）将葫芦素用作寄主识别线索和取食刺激物，这反映了植食者进化出的适应性，涉及感知、耐受、代谢或螯合，而非植物性状的第二项防御功能。特定系统中已证实了植食者诱导的葫芦素积累，但其调控机制和生态学普遍性仍未得到解决。与以往主要围绕葫芦素化学、药理活性或单一生物合成途径的综述不同，本综述整合了证据分级途径重建和分子调控，以及分类学分布、昆虫适应性、驯化和农业生态学后果。在机制层面，本综述追溯了母核形成、氧化修饰、偶联、组织特异性调控和转运如何通过植食者特异性感知、耐受、代谢和螯合产生截然相反的生态结果。研究人员得出结论，统一增加或消除葫芦素不太可能提供广泛有效的作物抗性，因为这两个方向都可能有利于不同的植食者类群。未来的优先事项包括候选基因的功能验证、空间分辨代谢物分析、非葫芦科谱系的比较研究，以及涉及广食性和专食性植食者、作物品质和非靶标生物体的田间评估。这些进展将为特定情境下的果实品质改良、行为害虫防治和病虫害综合治理策略提供支持，而非将葫芦素操作作为独立的抗性手段。
1. 引言
植物产生种类繁多的特化代谢物，有助于生态适应、植物-环境互作以及抵御植食者和病原体。类萜是植物天然产物中最大且结构最多样的类群之一，源自2,3-氧化角鲨烯的三萜类化合物通过不同的环化反应以及随后的氧化、酰化、糖基化等修饰，产生具有不同生物学功能的化合物。葫芦素是高度氧化的四环三萜类化合物，具有葫芦烷型碳骨架和强烈苦味。已鉴定出百余种葫芦素相关化合物，包括葫芦素A-T、糖基化衍生物及多种氧化、还原、酰化和重排形式。其生物学效应不仅取决于总浓度，还取决于化合物特性、偶联状态、组织定位及对互作生物的可及性。因此葫芦素积累不应被视为单一统一的化学或防御性状。
葫芦素最广为人知的是存在于葫芦科植物中，已报道至少100种约30个属。然而，葫芦素及相关的葫芦烷型三萜也出现在若干系统发育上相距甚远的植物谱系中，包括十字花科的屈曲花属、瑞香科的沉香属和杜英科的杜英属。在Iberis amara中鉴定出独立进化的葫芦素途径，证明相似的防御代谢物可通过不同氧化角鲨烯环化酶和细胞色素P450酶的招募和功能分化而产生。该发现表明葫芦素生物合成不一定源自单一的祖先途径，而可能在不同植物科中趋同进化。然而，分子证据仍集中于少数葫芦科作物，而许多非葫芦科物种的报道仍主要基于植物化学鉴定或基因组预测。
葫芦素生物合成的分子基础在黄瓜、甜瓜和西瓜中研究最为深入。这些物种中的研究已鉴定出参与葫芦素生物合成和苦味调控的母核形成氧化角鲨烯环化酶、细胞色素P450单加氧酶、酰基转移酶和组织偏好性转录调控因子。近期工作揭示了葫芦素积累的发育、激素和胁迫响应调控因子。然而，各途径组分的证据强度差异很大。部分酶和调控因子已获得遗传学和生物化学验证，而其他仍仅为基于基因组位置、序列同源性、共表达或代谢物关联推断的候选。因此区分实验验证组分与预测候选对于解读当前的生物合成和调控框架至关重要。
从植物角度来看，葫芦素主要作为防御代谢物，因为它们阻止许多广食性和非适应性植食者取食或降低其表现。黄瓜叶片中葫芦素C的积累与对二斑叶螨Tetranychus urticae的抗性相关。葫芦素B降低瓜蚜Aphis gossypii的存活率、寿命、繁殖力和种群增长，并影响解毒相关反应。从药西瓜Citrullus colocynthis中分离的葫芦素E对斜纹夜蛾Spodoptera litura引起取食抑制、死亡率和发育繁殖损害。然而，使用纯化合物、粗提物、离体组织或人工饲料获得的证据并非总能直接外推至完整植株，因为在完整植株中化合物定位、糖基化、与其他代谢物的互作及植食者行为可能改变生物学结果。
专食性瓜叶甲类甲虫呈现对比鲜明的情况。其中几种甲虫已进化出感觉和生理适应性，使其能够利用葫芦素作为寄主定位线索和取食刺激物，某些情况下还能在摄入后吸收、转化或螯合这些化合物。这些反应不应被解释为葫芦素对植物的第二种适应性功能，而代表了植食者对植物防御性状的反适应。这一区分在农业上很重要，因为瓜叶甲类甲虫包括主要作物害虫。例如，西方玉米根虫Diabrotica virgifera virgifera造成的产量损失和管理成本估计每年超过10亿美元。因此理解葫芦素介导的互作需要同时考虑植物防御和利用这些代谢物的植食者的进化适应性。
广食性和专食性植食者的相反反应对基于葫芦素的作物改良构成重要制约。组成性提高葫芦素浓度可能增强对某些广食性害虫的抗性，同时增加适应性专食者的寄主定位或取食。相反，降低葫芦素积累以改善果实适口性或减少专食者吸引，可能增加对非适应性植食者的敏感性。因此，无论是增加还是减少总葫芦素含量都可能无法提供普遍有效的作物保护。结果将取决于当地植食者群落、专食种和广食种的相对丰度、植物组织和发育阶段、化合物组成以及与其他防御性状的互作。基于葫芦素的干预措施应在农业生态学和病虫害综合治理框架内评估，而非作为孤立的单性状解决方案。
现有知识在各植物谱系、实验系统和证据水平上分布不均。功能研究主要集中在栽培葫芦科植物，而葫芦素在非葫芦科和木本物种中的进化起源、生态功能和调控机制相对缺乏特征描述。此外，同时量化葫芦素浓度、植食者行为、植食者表现、植物适合度及田间条件下对非靶标生物影响的研究相对较少。这些局限性限制了途径知识向可靠作物保护策略的转化。
以往的综述主要集中于葫芦素化学、药理活性或单一生物合成途径。相比之下，本综述整合了结构多样性、分类学分布、进化起源、生物合成、分子调控、植物防御、专食性植食者适应性、驯化和农业生态约束。特别关注区分经实验验证的发现与基因组或转录组候选，并评估不同实验系统获得的证据如何支持生态学和农学结论。通过整合植物化学、植物分子生物学、进化生态学和作物保护，本综述旨在界定以葫芦素为中心的可持续害虫管理策略的潜力和局限性。文献检索策略：在Web of Science核心合集、Scopus、PubMed和Google Scholar中检索截至2026年7月发表的研究。主要布尔检索框架为（"cucurbitacin*" OR "cucurbitane-type triterpenoid*"）AND（"biosynth*" OR "regulat*" OR "transport*" OR "distribution" OR "evolution" OR "plant–insect interaction*" OR "plant–herbivore interaction*" OR "herbivor*" OR "adaptation" OR "domestication" OR "breeding" OR "crop protection"）。针对昆虫的检索补充了（"insect*" OR "beetle*" OR "aphid*" OR "mite*" OR "lepidopter*" OR "Diabrotica" OR "Acalymma" OR "Epilachna" OR "Tetranychus" OR "Aphis" OR "Spodoptera"）。检索语法按要求调整。未使用NOT运算符，因其可能排除与植物化学、生物合成、生态学或作物保护相关的跨学科研究。通过筛选相关原始论文和综述的参考文献列表确定额外出版物。初步筛选标题和摘要，随后进行全文评估。提供植物材料、化合物特性、实验系统或生物反应信息充足的同行评审研究纳入范围。仅关注药物或临床活性的研究予以排除。证据层级按照补充表S1标准分级为已验证、支持、候选或情境相关。鉴于广泛的跨学科范围，本综述采用结构化叙述性综述而非正式荟萃分析。
2. 葫芦素的化学多样性与分布
葫芦素是一类化学多样的高度氧化四环三萜，具有强烈苦味和广泛的生物与生态活性。虽然最常与葫芦科关联，但葫芦素和相关的葫芦烷型代谢产物存在于多个植物科中。其分布分类学上不连续，定性组成和定量丰度因物种、基因型、器官、发育阶段和环境条件而异。葫芦素谱因此应被视为化学异质性和空间结构化的植物特化代谢组分，而非统一的化学分类学或防御性状。这种异质性对植物-植食者互作很重要，因为生态结果取决于化合物特性、偶联状态、组织可及性以及植食者的感觉和代谢适应性，而非仅取决于总葫芦素浓度。
2.1 结构多样性
葫芦素的特征是葫芦烷型四环碳骨架，通常源自葫芦二烯醇，并通过多种下游反应实现多样化。氧化、羟基化、酰化、糖基化、侧链还原和结构重排产生大量苷元、糖苷和部分修饰中间体。葫芦素按字母A-T传统命名，但该命名体系并未涵盖日益增多的天然类似物。现代代谢物谱分析表明葫芦素组成远复杂于少数主要字母命名化合物，尽管各注释的置信度不同。Chen等开发了快速筛查方法表征黄瓜叶、根、茎和花中葫芦素及其糖苷的分布，结合高效液相色谱/四极杆飞行时间质谱（HPLC-Q-TOF-MS）与源内裂解和碱金属加合物形成，筛查了40种推定葫芦素和葫芦素糖苷，提出了器官特异性代谢分布网络。该研究的价值不仅在于检测特征的数量，还在于证明黄瓜含有比主要命名化合物所代表的更广泛和空间结构化更强的葫芦素谱。从苦黄瓜叶中分离和结构表征的10种葫芦素C类似物（含7种此前未描述的化合物）为该化学多样性的一部分提供了更强的结构证据。糖基化和侧链修饰提供了额外的多样性来源。黄瓜UDP-糖基转移酶UGT73AM3催化苦味葫芦素中间体的发育调控性糖基化，将果实发育与苦味三萜的转化和储存联系起来。侧链饱和、异构化和氧化模式变异已在Citrullus naudinianus、胡黄连Picrorhiza kurrooa和Cucurbita texana中得到证实。这些修饰可能改变溶解度、细胞内转运、稳定性、组织储存以及植食者的识别或解毒。因此生物学活性研究应报告化合物特性、分析置信度、纯度、剂量、施用方法和偶联状态。
2.2 分类学分布与进化起源
葫芦素已在葫芦科约30个属至少100种植物中报道。含葫芦素或相关途径组分的栽培葫芦科植物包括黄瓜（Cucumis sativus）、甜瓜（Cucumis melo）、西瓜（Citrullus lanatus）、南瓜和笋瓜（Cucurbita spp.）、葫芦（Lagenaria siceraria）和丝瓜（Luffa spp.）。报道还扩展至野生、苦味或药用类群，包括药西瓜Citrullus colocynthis、Cucurbita texana、苦瓜属Momordica、栝楼属Trichosanthes、雪胆属Hemsleya（葫芦科）、喷瓜属Ecballium和泻根属Bryonia。这一多样性包括为降低果实苦味而选育的驯化作物以及保留高葫芦素积累的野生和药用植物。葫芦科内的分布既不均匀也不能仅凭分类位置可靠预测。对六个葫芦科属的十个物种进行的比较液相色谱-质谱分析检测到物种特异性组合的葫芦素B、E、I和E-葡萄糖苷。类似地，分析69个黄瓜自交系检测到葫芦素A-E和I的大量基因型变异，葫芦素C仅存在于6个品系中。这些结果表明近缘种或基因型可能在主导化合物上差异显著，而相似葫芦素可出现在较远缘类群中。葫芦科之外，至少15个分类学上远缘的植物科已报道葫芦素和相关的葫芦烷型代谢产物，代表例子包括十字花科的屈曲花属Iberis、秋海棠科的秋海棠属Begonia、杜英科的杜英属Elaeocarpus和瑞香科的沉香属Aquilaria，以及蔷薇科、茜草科和其他远缘被子植物谱系。其在被子植物系统发育上的零散分布表明分类学上不连续的发生，提示葫芦素生物合成可能有多次进化起源。在Iberis amara中，氧化角鲨烯环化酶和细胞色素P450酶的系统发育分析和功能表征证明葫芦素生物合成独立于葫芦科途径进化。十字花科和葫芦科途径招募不同的酶谱系并遵循不同的早期氧化路线，支持趋同进化而非单一祖先葫芦素途径的不间断遗传。分类学调查必须区分化学确认的葫芦素、推定注释的代谢物和广义的葫芦烷型三萜。有真实标准品、诊断性串联质谱、核磁共振或生化重建支持的结构鉴定比仅基于精确质量数、数据库匹配或转录组关联的注释提供更强的证据。
2.3 器官、个体发育和基因型特异性分布
现有器官和个体发育变异的证据主要来自葫芦科，尤其是黄瓜。葫芦素在根、茎、叶、花、果实、种子和维管组织中异质性分布。野生和苦味基因型常在多个器官中积累，而驯化品种通常果实苦味降低，但保留根或营养组织中一定的葫芦素产生。这种空间分离在生态和农学上很重要，因为它可以在限制可食用组织苦味的同时保持在易受害器官中的防御。与器官形成、组织成熟或植物年龄相关的变化代表个体发育轨迹而非环境诱导的可塑性。这些发育程序性变化应与干旱、激素或植食者取食等可逆或刺激依赖性反应区分。黄瓜定量研究说明不同器官和年龄依赖性轨迹。葫芦素C和23,24-二氢葫芦素C在叶和茎中检测到，葫芦素C浓度随叶片老化逐渐降低。更广泛的HPLC-Q-TOF-MS筛查也揭示了葫芦素及其糖苷在黄瓜叶、根、茎和花中的不同分布。这些结果表明单个葫芦素遵循化合物和组织特异性个体发育模式，而非简单进行泛化的"发育动态"变化。黄瓜果实内部也存在显著异质性。苦味品种'Hanzil'中，葫芦素C浓度随果实增大而增加，并在果皮组织间差异显著。内果皮浓度最高，其次为中果皮和外果皮，而非苦味品种'Vlaspik'中葫芦素C及其糖苷未被检测到。黄瓜中这种复杂的组织和发育阶段依赖性模式与葫芦属Cucurbita中的经典案例形成对比，后者果实苦味被报道为由一个位点两个等位基因控制的简单孟德尔性状，苦味为隐性表型。这一对比表明苦味的遗传结构不能推广至所有葫芦科作物。基因型依赖性变异已在黄瓜和丝瓜中记录。在69个黄瓜自交系中，葫芦素C仅存在于一小部分基因型中，而挥发物和形态特征显示额外独立模式。在棱角丝瓜Luffa acutangula中，比较苦味和非苦味果实的整合代谢组学和转录组学分析检测到131种差异积累代谢物。异葫芦素B、葫芦素D、23,24-二氢葫芦素E和葫芦素F在苦味基因型中显著更丰富，同时Bi、细胞色素P450和酰基转移酶基因表达增加。这些结果表明果实苦味可能反映多个葫芦素的协调变化，而非单一主导化合物的变异。亚细胞区室化提供了额外的空间组织层级。黄瓜多药和有毒化合物外排/解毒转运蛋白CsMATE1与葫芦素C生物合成基因物理关联和转录共调控，并介导葫芦素C在叶肉细胞中的液泡螯合。生物合成与转运的协调可能降低自毒作用，同时维持储存的化学库使其在细胞破裂后可被利用。生态暴露因此取决于亚细胞储存和释放以及组织总体浓度。
2.4 环境与植食者诱导的可塑性
环境可塑性是指响应外部刺激而产生的葫芦素浓度或组成变化，而非正常器官发育相关的单向变化。温度、水分状况、矿质营养、植物生长调节剂、激素信号和植食均与苦味或葫芦素相关反应有关联，但不同形式的证据不支持同等结论。在受控刺激前后直接定量单个葫芦素可提供代谢物诱导或抑制的证据。相比之下，仅凭苦味、途径基因表达或转录因子活性的变化表明可能的调控反应，但不能证明葫芦素浓度相应变化。目前最有力的环境响应转录调控机制证据来自棱角丝瓜。干旱和脱落酸（ABA）处理增加Bi、细胞色素P450和酰基转移酶基因表达，酵母单杂交和双荧光素酶实验证明ABA响应转录因子LaAREB1结合并激活LaBi启动子。这些实验确立了ABA信号对核心生物合成基因的直接调控。然而，由于转录激活和代谢物积累并非等价测量，仍需要对单个葫芦素进行靶向定量以确定最终化学响应。关于植食，组织中葫芦素浓度在植食者取食后增加足以证明植食者诱导积累。在苦黄瓜中，Agrawal等发现二斑叶螨Tetranychus urticae取食增加局部受损子叶和未受损系统叶中的葫芦素C，提供了局部和系统诱导的直接证据。在西葫芦中，叶片损伤增加葫芦素B和D浓度。然而诱导并非在所有植物-植食者组合中普遍存在。McCloud等在南瓜甲虫Epilachna borealis取食沟内或沟外均未检测到葫芦素积累。同样，Diabrotica balteata幼虫取食在所检测的黄瓜品种和组织中仅引起葫芦素浓度的微小变化。这些看似矛盾的发现表明植食者诱导的葫芦素积累取决于植物种类和基因型、植食者身份、取样器官、局部与系统组织以及测量时间。
3. 葫芦素的生物合成途径
葫芦素生物合成代表植物三萜代谢的一个特化分支。该途径可分为四个主要模块：通过胞质甲羟戊酸途径形成前体、2,3-氧化角鲨烯环化为葫芦二烯醇、细胞色素P450单加氧酶的氧化修饰，以及末端酰化、糖基化、还原或转运。上游前体产生反应广泛保守，而下游酶在不同植物谱系间差异显著。因此葫芦素多样性通过谱系和组织特异性的氧化角鲨烯环化酶、P450、转移酶、氧化还原酶和转运相关蛋白组合产生。
3.1 通过甲羟戊酸途径形成前体
葫芦素碳骨架主要源自胞质甲羟戊酸途径。乙酰辅酶A依次转化为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）、甲羟戊酸、异戊烯基二磷酸、二甲基烯丙基二磷酸和法尼基二磷酸。两个法尼基二磷酸分子随后由角鲨烯合酶缩合形成角鲨烯，再经角鲨烯环氧酶氧化产生2,3-氧化角鲨烯。由于2,3-氧化角鲨烯也是植物甾醇和其他三萜途径所必需的，葫芦素生物合成与必需的甾醇代谢竞争共享前体库。雪胆Hemsleya macrosperma的比较转录组和生化分析确认了角鲨烯环氧酶HmSE1的活性，并将上游途径基因表达与葫芦素IIa积累联系起来。HcSE1和HcSE2的功能表征以及甲羟戊酸途径的模块化增强进一步提高了工程酵母中2,3-氧化角鲨烯的可用性和葫芦素IIa中间体的产生。相关异源酵母重建表明增加前体供应、优化葫芦二烯醇合酶表达和减少甾醇分支竞争可以提高葫芦烷型中间体的产量。
3.2 葫芦烷骨架的形成
第一个关键步骤是由特化氧化角鲨烯环化酶将2,3-氧化角鲨烯环化为葫芦二烯醇，通常命名为Bi、CBS、CPQ或物种特异性OSC。在南瓜中，CPQ被证明产生葫芦二烯醇，而相关CPX酶产生环阿屯醇用于植物甾醇生物合成。这确立了葫芦素形成由区别于甾醇相关OSC的特化环化酶启动。罗汉果Siraitia grosvenorii、苦瓜和蛇瓜Trichosanthes cucumerina的功能研究随后确认了密切相关的OSC可产生不同的葫芦烷、多花烷、齐墩果烷或甾醇骨架。因此仅凭系统发育位置或基因注释不足以指定OSC功能，异源产物鉴定仍是必需的。雪胆Hemsleya chinensis的HcOSC6是特征最明确的葫芦二烯醇合酶之一。定点突变鉴定E246、M261和D490为影响催化活性的重要残基。在原生植物中，HcOSC6过表达增加葫芦二烯醇积累，而CRISPR/Cas9编辑降低其丰度，提供了其在葫芦素生物合成中作用的直接遗传证据。
3.3 细胞色素P450单加氧酶的氧化修饰
葫芦二烯醇缺乏成熟葫芦素特征的广泛氧化。细胞色素P450单加氧酶将羟基、羰基和其他含氧基团引入四环核和侧链，从而产生途径内大部分结构多样性。在苦瓜中，CYP81AQ19催化C-23羟基化，而CYP88L7和CYP88L8催化C-7和C-19羟基化的不同组合。这些酶证明P450区域选择性的差异如何产生不同的葫芦烷结构。在雪胆H. chinensis中，HcCYP87D20和HcCYP81Q59在工程酵母和烟草Nicotiana benthamiana中得到功能表征。它们与HcSEs和HcOSC6的组合表达能够产生氧化葫芦素IIa中间体并阐明若干途径反应。
3.4 酰化、糖基化和途径分支
在P450介导的氧化之后，酰基转移酶、糖基转移酶、氧化还原酶和相关酶产生额外的葫芦素衍生物。这些末端修饰影响溶解度、稳定性、细胞内定位、转运、储存和生物活性。在雪胆H. chinensis中，HcAT1被证明催化与葫芦素IIa生物合成相关的乙酰化步骤。在南瓜Cucurbita pepo中，毛状根培养物——由发根农杆菌Rhizobium rhizogenes诱导的遗传转化根培养物，而非根毛区——被用作受控系统测试选定的P450和酰基转移酶。这些酶的表达重定向内源中间体并改变葫芦素B、D、E和I的相对丰度。由于R. rhizogenes转化本身可能改变寄主代谢，毛状根结果需要分离酶特异性效应与转化效应的对照。在C. pepo中，转化引起广泛的转录组和代谢组变化并降低转化根中的内源葫芦素积累。因此解释途径重建实验需要未转化根和空载体毛状根品系作为对照。糖基化提供另一个主要多样性来源。罗汉果S. grosvenorii中相关葫芦烷糖苷的研究表明连续糖基化可产生高度修饰的产物。然而，参与罗汉果苷生物合成的酶不应自动被指定在葫芦素途径中具有等价作用。大多数葫芦素糖苷和酰化衍生物仍缺乏实验验证的生物合成酶。
3.5 基因组组织、进化和证据评估
葫芦素生物合成基因常位于部分聚集的基因组区域，包含Bi型OSC、P450、酰基转移酶、氧化还原酶或转运相关基因。然而并非这些区域内所有基因都必然参与葫芦素产生，若干必需基因可能位于基因组其他位置。途径组织因植物种类而异。在南瓜C. pepo中，主要途径基因位于两个染色体区域，而雪胆属Hemsleya物种的转录组研究鉴定出许多分散候选基因，仅部分获得功能验证。这些模式表明葫芦素途径通过基因重复、丢失、转位、招募和功能分化而进化。强有力的途径分配需要互补证据。基因组位置、系统发育位置、共表达和转录-代谢物相关性对候选发现有用，但不能证明酶促或调控功能。本综述中，异源表达、纯化酶测定、遗传获得或功能丧失分析或转运测定后的直接产物鉴定被视为功能验证；启动子结合、瞬时激活和无原生遗传确认的途径重建被视为支持证据。重建研究表明途径模块可在受控条件下组合，但技术可行性不是农学理由。因为较高葫芦素水平可能阻止广食性害虫同时刺激适应性专食者，途径操作应仅在评估生态权衡、可食用组织品质、非靶标效应和田间环境后才考虑。
4. 葫芦素生物合成的分子调控
葫芦素积累受调控网络控制，决定生物合成基因表达的时间、位置和强度。当前证据支持一个新兴的组合模型，其中组织偏好性碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子形成主要调控层，而发育程序、激素信号、环境条件和辅助调控因子修饰途径活性。转运和代谢物周转进一步影响最终葫芦素谱。
4.1 bHLH转录因子的核心调控作用
比较基因组学支持bHLH转录因子在葫芦素生物合成空间调控中的重要性。对来自七个葫芦科作物的1160个bHLH基因的分析揭示了保守的苦味相关转录因子簇以及谱系特异性重复和分化。还鉴定了一个包含候选根相关调控因子Brp的旁系同源簇，表明祖先bHLH基因的重复促进了果实、叶和根中部分独立调控模块的发展。这种组织为葫芦素积累在同一植物不同器官间的差异提供了分子解释。密切相关的bHLH蛋白可能识别相似的E-box元件，但表达模式、DNA结合效率、互作伴侣和靶基因特异性不同。组织偏好性调控应被解释为定量且部分重叠的系统，而非一组完全独立的开关。苦味相关bHLH基因的进化扩增有助于解释器官特异性葫芦素积累和果实驯化过程中营养防御的保留。
4.2 协同和组合调控
最近的遗传证据表明葫芦素调控可涉及相关bHLH蛋白之间的协同。在甜瓜中，CRISPR/Cas9分析显示CmBt主要调控叶片中葫芦素B积累，而其旁系同源物CmBr在果实和根中效应更强。CmBt和CmBr蛋白物理互作并协同激活母核形成基因CmBi。双突变体葫芦素B降低程度大于任一单突变体，并完全阻止氯吡脲（CPPU）诱导的果实苦味。这些发现修正了每个调控因子仅控制一个器官的简单模型。相反，葫芦素生物合成基因似乎整合来自多个转录因子的重叠输入。最终途径活性可能取决于其相对丰度、二聚化、启动子亲和力及与额外蛋白的互作。辅助调控因子为组合调控提供了进一步证据。在甜瓜中，CmRSM1结合并激活CmBr启动子并促进CPPU诱导的苦味。CmWRKY13激活多个葫芦素B生物合成基因并与CmBt蛋白互作。在棱角丝瓜中，LaAREB1结合并激活候选母核形成基因LaBi的启动子，将脱落酸相关信号与途径调控联系起来。然而这些因子的证据水平不同。CmRSM1的作用有启动子结合、反式激活和遗传分析支持，而CmWRKY13和LaAREB1的分配主要依赖启动子测定和蛋白互作证据，缺乏全面的原生功能丧失验证。
4.3 发育、激素、环境和植食者诱导的调控
葫芦素丰度在果实发育过程中发生显著变化。在甜瓜中，苦味基因型在果实发育早期表现出高葫芦素B浓度和生物合成基因表达升高，随后在成熟过程中逐渐下降。非苦味基因型在整个发育过程中维持低代谢物和转录水平。更近期的甜瓜种质转录组和代谢组分析显示发育变化不仅涉及生物合成的转录调控。激素信号、衰老、萜类代谢、生长分配和ATP结合盒（ABC）转运蛋白表达的差异与葫芦素B积累和清除相关。11个ABC转运蛋白基因与葫芦素B动态强烈相关。这些相关性为葫芦素转运或周转确定候选，但不能证明转运蛋白功能。植物生长调节剂可干扰这种发育平衡并诱导不良果实苦味。当前遗传证据表明对CPPU的响应取决于CmBt-CmBr模块的联合活性。直接代谢物测量证明葫芦素积累可在特定实验系统中被诱导，但该响应并非普遍。Tetranychus urticae取食增加苦黄瓜中葫芦素C浓度，而叶片损伤增加西葫芦中葫芦素B和D浓度。相比之下，McCloud等在南瓜甲虫Epilachna borealis取食沟内或沟外均未检测到葫芦素积累。
4.4 自然变异、驯化和比较缺口
转录因子基因及其调控区的自然变异对不同基因型间葫芦素积累差异贡献显著。基因重复和分化产生器官偏好性调控模块，而作物选择偏向降低可食用果实苦味的等位基因。这种调控修饰比消除整个途径更有利，因为防御能力可保留在营养或地下器官中。近期甜瓜研究说明了调控变异的潜在价值和局限性。破坏CmBt和CmBr两者消除CPPU诱导的果实苦味，将这些位点确定为稳定果实品质的潜在靶标。然而跨组织同时抑制可能削弱对广食性植食者的威慑，同时减少对葫芦素适应性专食者的吸引或取食刺激。因此农学结果不能仅凭果实苦味预测。葫芦科以外的调控证据仍然有限。在形成沉香的组织中，红光和远红光处理与葫芦素产量、转录本丰度、小RNA谱和DNA甲基化变化相关。这些结果支持葫芦烷型代谢可能存在光响应和表观遗传调控，但相关转录因子、直接靶基因和因果关系尚未建立。
4.5 当前调控模型和证据限度
现有证据支持葫芦素调控的组合模型。组织偏好性bHLH因子提供主要特征化的转录输入，而相关bHLH蛋白可能通过物理互作和共享靶启动子协同作用。发育、激素、环境和植食者相关信号可进一步修饰途径活性。转运、螯合、代谢周转和资源分配随后塑造最终葫芦素谱。然而核心bHLH调控因子之外的证据仍不均衡。
5. 葫芦素在植物-植食者互作中的对比性生态后果
葫芦素被广泛视为防御性特化代谢物，因为其苦味和毒性可降低许多葫芦素敏感植食者的寄主接受度并损害其表现。从植物角度看，这些威慑和毒性效应构成防御功能。相比之下，葫芦素适应性瓜叶甲类甲虫的接触识别、停留和取食刺激反映了利用植物化学线索的植食者适应性，而非植物代谢物的第二种功能。
5.1 组成性防御与驯化
组成性葫芦素在植食者攻击前即存在，可立即影响昆虫寄主选择、取食、存活、生长和繁殖。其在根、子叶、幼叶和其他易受害组织中的积累与植物早期发育阶段的防御作用一致。野生和驯化南瓜之间的比较提供了作物选择改变组成性葫芦素防御的直接证据。野生Cucurbita argyrosperma种群的根和子叶中葫芦素浓度显著高于驯化品种，多个途径相关基因表达也更高。Diabrotica balteata和Acalymma spp.幼虫偏好野生根，但高葫芦素组织降低D. balteata的表现，对更耐受葫芦素的Acalymma spp.负面影响较小。C. pepo的独立驯化事件也产生子叶葫芦素积累和葫芦素适应性甲虫偏好的显著差异。遗传定位鉴定了一个包含候选调控和转运基因而非仅核心生物合成酶的主要位点，表明驯化可通过调控和代谢物分布的改变重塑化学防御。这些发现表明驯化相关的葫芦素积累降低不具有统一的生态后果。
5.2 植食者诱导和系统响应
植食者或损伤诱导葫芦素积累的证据是系统依赖性的。Tetranychus urticae取食增加苦黄瓜中葫芦素C浓度，而叶片损伤增加西葫芦中葫芦素B和D。相比之下，南瓜甲虫Epilachna borealis取食沟内或沟外均未检测到积累。D. balteata取食在C. argyrosperma中产生品种和器官特异性的防御相关基因表达和毛状体产生变化，而另一项黄瓜研究仅检测到微小或品种依赖性变化。同样，地上植食降低Acalymma vittatum幼虫随后的根偏好，但未增加黄瓜叶或根中的葫芦素C浓度。因此基因表达、物理防御、生物量或植食者偏好的变化不应在没有代谢物本身定量增加的情况下被解释为葫芦素诱导。
5.3 对葫芦素敏感植食者的威慑和毒性效应
对许多葫芦素敏感植食者而言，葫芦素作为取食威慑物、产卵威慑物、毒素或发育抑制剂。使用葫芦素B的选择实验证明减少了数种甲虫和鳞翅目幼虫的取食以及欧洲玉米螟Ostrinia nubilalis和甜菜夜蛾Spodoptera exigua的产卵。但各取食类群的反应不均一，部分汁液取食昆虫对葫芦素处理基质呈中性或阳性反应。化学结构强烈影响生物活性。使用修饰葫芦素衍生物的比较测定表明相对较小的结构变化产生物种特异性拒食效应变化。威慑多食性夜蛾科昆虫的化合物不一定威慑葫芦相关专食者，且一种修饰衍生物刺激专食者取食。因此一种纯化葫芦素的结果不能推广至整个化合物类别。
5.4 葫芦素适应性甲虫的接触识别和取食刺激
在瓜叶甲类甲虫中，葫芦素作为主动取食刺激物而非仅未能威慑取食的化合物。葫芦属物种的比较分析揭示组织葫芦素含量与南方和西方玉米根虫的停留和取食强度之间呈正相关。对19个物种和46个品种的葫芦属、黄瓜属和西瓜属分析进一步证明子叶葫芦素组成和浓度强烈影响甲虫取食行为。该响应的感觉基础已在成年西方玉米根虫中研究。下颚外颚叶上的化学感觉毛在浓度低至0.1 μM时对葫芦素B产生电生理响应。双侧移除
