《Cell Reports》：Mesenchymal drift in ciliopathy iPSC-derived RPE reveals a convergent pathogenic cell state
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纤毛病包含一系列涉及150多个基因突变的疾病，这些突变影响初级纤毛，其突出特征为视网膜变性，由光感受器和视网膜色素上皮（RPE）的协同发育与成熟缺陷驱动。目前的单基因靶向治疗策略成本高昂且可扩展性有限。研究人员假设在初级纤毛功能障碍的下游，存在与突变无关的共享
纤毛病包含一系列涉及150多个基因突变的疾病，这些突变影响初级纤毛，其突出特征为视网膜变性，由光感受器和视网膜色素上皮（RPE）的协同发育与成熟缺陷驱动。目前的单基因靶向治疗策略成本高昂且可扩展性有限。研究人员假设在初级纤毛功能障碍的下游，存在与突变无关的共享通路启动组织缺陷。为验证这一假设，研究人员从九名患有严重视网膜变性的纤毛病患者（涉及BBS1、BBS10、BBS16、CEP290、LCA5、MYO7A、PRPF31基因）中建立了诱导多能干细胞来源的RPE模型（iRPE）。尽管疾病严重程度存在异质性，但与潜在的纤毛结构缺陷一致，所有纤毛病iRPE均表现出异常的上皮极化和线粒体健康受损，这些现象由失调的TGF-β信号驱动的间充质漂移所引发。针对这些与基因无关的疾病表型，该研究确定了两种药物——吡格列酮（一种线粒体代谢调节剂）和加卢尼塞替尼（一种TGFBR1抑制剂）——作为多种纤毛病亚型的潜在治疗候选药物。
**论文解读：纤毛病视网膜色素上皮细胞的趋同致病状态与治疗策略发现**
**一、研究背景**
初级纤毛是存在于几乎所有人类细胞表面的微管-based高度特化细胞器，作为感知和整合细胞外信号的关键枢纽，调控WNT、Sonic Hedgehog和TGF-β等重要发育通路。纤毛结构或功能破坏导致一类统称为纤毛病的遗传性疾病，其临床特征常包括肥胖、多指（趾）畸形、肾囊肿和视网膜变性，其中视网膜变性最为常见。既往纤毛病相关视网膜变性研究聚焦于光感受器连接纤毛及光感受器发育。近期研究表明，除光感受器变性外，初级纤毛的整体缺失还伴随视网膜色素上皮（RPE）的结构和表型缺陷。RPE是对光感受器支持至关重要的单层高度极化上皮细胞，承担营养转运、视循环支持和吞噬光感受器外节等功能。研究人员前期工作证明，小鼠RPE中选择性清除纤毛运输蛋白IFT20足以诱导致病性RPE表型和进行性光感受器变性。然而，纤毛病治疗策略多靶向光感受器且疗效有限，突变特异性疗法因纤毛病个体基因异质性大、患者稀少而面临可扩展性和商业可行性障碍。因此，迫切需要寻找纤毛功能障碍下游、与突变无关的共享疾病机制，以开发惠及更广泛纤毛病患者的治疗策略。
**二、研究内容与结论**
研究人员采用基于新方法学（NAM）的策略，利用九名患有严重视网膜变性、携带七个纤毛相关基因（BBS1、BBS10、BBS16、CEP290、LCA5、MYO7A、PRPF31）突变的患者来源iPSC分化RPE模型，系统定义不同纤毛病间的共享RPE表型。研究发现，尽管各患者来源iRPE系呈现独特的结构性纤毛缺陷，但所有细胞均表现出趋同的表型——顶-底极性不完整和六边形细胞几何形态丧失。转录组分析和功能检测揭示，所有患者iRPE存在线粒体功能缺陷、TGF-β信号持续激活和间充质样转录景观诱导的共同表型。研究人员将其定义为“间充质漂移”，特征为上皮特征侵蚀、细胞几何形态改变和连接重塑，而非完全的上皮-间充质转化。基于这些通路缺陷，靶向药物筛选鉴定出吡格列酮（线粒体代谢调节剂）和加卢尼塞替尼（TGFBR1抑制剂）两种临床阶段化合物，可在多种患者细胞系中独立于潜在突变挽救RPE极性、形态和基因表达。该研究证明遗传异质性的纤毛突变汇聚于共享的RPE疾病机制，确立RPE极化侵蚀作为纤毛病相关视网膜变性的常见、突变无关细胞表型，为开发靶向共享下游生物学而非个别基因缺陷的广谱治疗策略提供了NAM-based平台。论文发表在《Cell Reports》。
**三、主要技术方法**
该研究使用了以下关键技术方法：患者外周血单个核细胞（PBMC）分离及仙台病毒重编程建立iPSC系并分化iRPE；透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）评估细胞超微结构；跨上皮电阻（TER）和τ比值（tau ratio）测量评估RPE膜极化和离子通道不对称分布；基于机器学习的REShAPE软件进行单细胞形态计量分析；CiliaQ软件进行纤毛三维分割和长度测量；批量RNA测序结合基因集变异分析（GSVA）和基因本体（GO）富集分析；Seahorse代谢分析仪测定线粒体ATP产生和备用呼吸能力；NELLIE软件定量线粒体体积；靶向药物筛选（96孔板初筛和Transwell复筛）。
**四、研究结果**
**1. 结构和功能多样性纤毛突变患者的视网膜变性临床表现**：研究人员纳入九名代表不同纤毛病亚类的患者（Bardet-Biedl综合征、Joubert综合征、Leber先天性黑矇、Usher综合征和视网膜色素变性），基因突变涉及纤毛结构、运输和BBSome组装等功能。临床检查显示这些患者存在不同严重程度的视网膜变性，多数患者表现出明显的视网膜色素异常和视力下降。
**2. 基于NAM的纤毛病iPSC-RPE比较平台开发**：九种纤毛病iPSC成功分化为RPE，分化效率与对照相当。纤毛结构分析显示广泛的表型异质性：CEP290-iRPE纤毛延长58%，BBS16-iRPE缩短17%；CEP290主要呈现膨出状纤毛，LCA5、PRPF31和MYO7A呈现弯曲或卷曲纤毛；多数患者系存在微管谷氨酰化改变（BBS1A/B、BBS10A/B和MYO7A高谷氨酰化，BBS16和CEP290低谷氨酰化）和IFT88转运异常。根据纤毛特征受影响数量排序，CEP290、LCA5、PRPF31和MYO7A-iRPE表现出最严重的结构和转录异常。
**3. 携带不同初级纤毛基因突变的患者来源iRPE中趋同上皮极性缺陷**：所有纤毛病iRPE均显示τ比值>1.5（对照约1.5），VEGF分泌极性异常或增加，Na-K-ATP酶基底外侧延伸、EZRIN染色显示顶面扁平不平等极性缺陷。细胞高度降低至对照的约60%（BBS16除外）。REShAPE形态计量分析显示多数患者iRPE细胞面积增大（BBS10A/B、CEP290、LCA5、MYO7A约为对照两倍）、六边形评分降低和长宽比增加。转录组分析鉴定642个共同下调和688个共同上调基因，GO分析揭示连接组装、顶-底极性、视循环、细胞外基质和细胞因子/受体活性通路显著改变。功能实验发现患者iRPE吞噬光感受器外节（POS）能力较对照高4倍。
**4. 纤毛病iRPE细胞能量产生缺陷与线粒体结构异常相关**：GSVA分析显示线粒体是普遍受影响的细胞器。TOMM20免疫染色和三维重建显示纤毛病iRPE线粒体融合、管状化并向外周扩散，TEM确认线粒体超融合伴嵴结构紊乱。NELLIE定量显示线粒体体积增加2-4倍，但Seahorse检测显示线粒体呼吸效率降低2-5倍，六分之九的细胞系备用呼吸能力降低1-2倍，提示ATP输出减少源于氧化磷酸化效率低下。
**5. 纤毛病iRPE间充质漂移与TGF-β信号上调相关**：多种间充质转化相关基因（TWIST1、COL6A3、COL1A2等）表达增加2-8倍，VIMENTIN表达和胞质定位增加，间隙连接蛋白CONNEXIN43表达降低1-3倍，β-CATENIN细胞周边弥漫分布，TEM显示细胞连接破坏。GSVA通路分析显示TGF-β通路富集分数最高，pSMAD2核内信号较对照高1.5-3倍，表明TGF-β信号持续激活。
**6. 表型药物筛选发现加卢尼塞替尼和吡格列酮可改善纤毛病iRPE间充质漂移**：基于REShAPE读出的初筛在BBS10B、LCA5和CEP290 iRPE中进行。加卢尼塞替尼（10μM）和吡格列酮（1-10μM）显著减小细胞面积和降低伸长率。复筛中两药改善细胞形态（LCA5面积：未处理148μm2，吡格列酮128μm2，加卢尼塞替尼136μm2）、降低FIBRONECTIN表达、增加细胞高度（加卢尼塞替尼10-40%，吡格列酮2-30%）、恢复顶面微绒毛起伏形态、部分恢复Na-K-ATPase顶侧定位、改善β-CATENIN和CONNEXIN43连接信号，并减少非纤毛细胞比例。
**7. 吡格列酮和加卢尼塞替尼通过独立通路逆转间充质漂移相关基因特征**：RNA-seq主成分分析显示药物处理将纤毛病iRPE全局基因表达谱向对照方向移动，加卢尼塞替尼效应强于吡格列酮。通路分析显示线粒体生物发生、ATP合成、线粒体呼吸和脂肪酸氧化通路上调，间充质转化、细胞外基质、MAPK激酶和TGF-β信号通路下调。吡格列酮增加AMPK磷酸化（CEP290 +60%，LCA5 +197%，BBS10 +84%），不改变PPAR-γ水平，并增加COX4蛋白水平；加卢尼塞替尼升高PPAR-γ水平（CEP290 +35%，LCA5 +25%）而不改变pAMPK，降低pSMAD2（CEP290 -69%，LCA5 -48%，BBS10 -67%）和αSMA水平。吡格列酮处理后线粒体ATP产生增加至2倍。两种药物通过不同但部分汇聚的机制发挥作用：线粒体增强和TGF-β抑制。
**五、讨论与结论**
讨论部分指出，纤毛病的遗传异质性限制了突变特异性治疗策略的转化影响，NAM-based方法能够无偏发现跨基因型的趋同致病通路。九个患者iRPE样本表现出基因和突变特异性的纤毛破坏模式，但极化侵蚀和间充质漂移是共享细胞结局。PRPF31突变iRPE尽管患者临床表型相对温和，但细胞表型严重，提示RPE细胞特异性脆弱性。TGF-β信号持续激活是间充质漂移和极化侵蚀的核心驱动因素，数据支持异常TGF-β信号可能位于线粒体损伤上游。两种临床阶段小分子药物吡格列酮和加卢尼塞替尼在多种纤毛病基因型中稳健挽救共享RPE疾病细胞表型，支持其通过505(b)(2)监管路径进行药物重定位的潜力。研究局限性包括未能覆盖全部200多个纤毛病基因、仅捕获RPE细胞自主性表型、部分患者突变罕见难以平衡性别差异、药物未完全恢复线粒体超微结构等。
**研究结论**：遗传多样性的纤毛突变汇聚于共享的RPE疾病机制，RPE极化侵蚀是纤毛病相关视网膜变性中常见的、与突变无关的细胞表型。TGF-β信号和线粒体功能障碍是驱动该疾病状态的关键通路，吡格列酮和加卢尼塞替尼作为潜在治疗候选药物，为开发靶向共享下游生物学的广谱纤毛病治疗策略提供了NAM-based平台。
