瓶颈繁殖使合作细菌能够清除作弊者

《iScience》：Bottlenecked reproduction enables cooperating bacteria to purge cheaters

　　

摘要

细菌通过社会性合作来确保在不利环境中的生存和繁殖。大量的细菌社会性基因（SG）专门负责此类合作。携带社会性基因功能缺失突变（LOFM）的突变细菌经常受到合作野生型同伴的保护，从而逃避净化选择。然而，在缺乏有效清除机制的情况下，这些突变体会持续存在并在细菌群体中增殖，最终使合作能力瘫痪。我们提出了"合作焦点处的瓶颈式繁殖"（BRFC）假说来应对这一问题。该假说规定，细菌在合作定殖焦点处的繁殖受到瓶颈限制，使得极少个体能够启动增殖和扩散。需要注意的是，携带社会性基因LOFM的突变个体与其野生型同伴一样可能逃脱瓶颈。然而，若这种情况发生，由此产生的突变谱系在扩散到新位点后，将无法实现新一轮繁殖。验证这一假说将揭示可用于对抗细菌疾病的细菌弱点。

图形摘要

引言

人类、动物和植物的细菌病原体，如肠侵袭性大肠杆菌、肺炎链球菌（Spn）、铜绿假单胞菌和欧文氏菌属的油菜假单胞菌，大多为具有单倍体基因组的单细胞原核生物。人们可能认为这些细菌的细胞是各自独立追求自身增殖的孤立的个体。然而，事实是，同种细菌个体以细胞间合作行为而闻名，尤其是在宿主组织或细胞内，以确保其生存和繁殖。进一步已确立的是，这种细胞间合作在合作细菌个体中是由基因编程的。一个尚未解决的问题是细菌如何清除赋予合作能力的社会性基因（SG）中的功能缺失突变（LOFM）。这类LOFM可被预期会自发产生，最初仅存在于极少数细菌个体中。含有相应LOFM的突变个体常被称为"欺骗者"，因为它们尽管逃避了为共定殖位点提供可共享公共物品的职责，却盗取同伴提供的公共物品以促进自身增殖。然而，社会欺骗者的增殖威胁了相关细菌群体和物种的长期生存，因为被欺骗者过度负担的群体注定会逐步退化，最终导致灭绝——一种被称为"公地悲剧"的结果。

相反，适应性良好的细菌物种可被预期编码了能够认真清除社会欺骗者的策略。已提出若干策略来承担这一角色，包括亲缘选择、频率依赖性选择、空间结构化和直接杀死欺骗者。然而，大多数这些策略仅能解释部分细菌社会性。更重要的是，这些策略的遗传和进化机制仍有待阐明。受我们关于同种病毒个体共享同一感染细胞的先前工作启发，以及蜜蜂等真社会性昆虫的已知行为，我们提出一个新假说，称为"合作焦点处的瓶颈式繁殖"（BRFC），该假说很可能提供一种使社会欺骗者能够被从细菌群体中持续移除的自然选择解决方案。BRFC假定，为了及时有效地清除社会欺骗者，在共定殖位点合作共处的细菌实行瓶颈式繁殖，以排除大多数合作个体的增殖性分裂。此外，BRFC很可能以遗传方式编码在成功的细菌病原体的基因组中，并且可能为先前作者提出的其他欺骗者清除策略提供机制解释。最后，该假说的关键预测可以相对容易地进行检验；而控制BRFC的基因一旦被鉴定和表征，可被靶向用于细菌感染的治疗。

细菌间合作的三个实例

细菌间合作有多种形式。例如，共定殖细菌已知会以协调的方式分泌消化酶来降解周围环境中的固体物质，产生可溶性碳水化合物和其他营养物质供集体消耗。细菌产生铁载体铁螯合剂也被公认为在大量共定殖细菌个体之间具有高度协调性。在此，我们将使用三个实例来说明合作对于细菌在自然环境中生存和繁殖的必要性。

III型分泌系统

III型分泌系统（T3SS）是一种相对直接的同种细菌间合作形式，被许多动物和植物致病细菌编码，如肠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌和植物病原油菜假单胞菌。T3SS装置由30多种不同蛋白质组成，共同组装成注射器样注射器。它负责将数十种细菌效应蛋白（称为T3SS效应物或T3E）分泌到宿主组织和细胞中，以抑制宿主免疫并增强感染成功率。对于给定细菌而言，编码T3SS注射器组分和T3E的细菌基因总数通常超过60个。

T3SS对于这些细菌定殖其宿主是必不可少的；然而，T3SS组分和T3E中的LOFM很少损害细菌在体外培养中的适应性。事实上，LOFM可以在感染宿主组织内产生并短暂增殖，且携带突变的个体——欺骗者——在某些条件下经常比其野生型同伴更具竞争力。T3E必须被导出到单个细菌细胞外的空间才能发挥其活性。因此，其益处被所有驻留在同一定殖焦点的个体所共享。由此，逃避产生或分泌功能性T3E责任义务的欺骗者仍可通过受益于共定殖姐妹细胞分泌的T3E而繁盛，除非存在一种能持续惩罚突变个体的监控机制。更令人担忧的是，在缺乏此类监控的情况下，越来越多的T3SS组分和T3E可在不同细菌个体中获得LOFM，且通过快速细菌繁殖，此类突变的群体水平频率也将稳步上升。这些事件最终将导致相关细菌群体的灭绝。

我们要重申，我们的讨论仅涉及属于同种、同株或同分离株的共定殖细菌个体。对于这些编码（几乎）相同T3SS和T3E的同种细菌个体，胞外T3E仅使分泌该效应物的个体受益，这在逻辑上是不可想象的，特别是考虑到大多数T3E通过操纵周围宿主组织和/或细胞来发挥作用，从而创建了一个有利于所有共定殖同伴的环境。此外，单个细菌个体产生的T3E不太可能达到其作用所需的浓度阈值。

T3SS的合作性质得到了多项研究的支持。例如，Ruiz-Bedoya及其同事通过每个突变体仅保留一个效应物基因（总共36个），从油菜假单胞菌番茄致病型（Pst）DC3000创建了36个突变体群体。他们发现没有任何突变体能单独感染宿主植物（拟南芥），但将所有36个突变体组合在同一接种物中可恢复细菌致病力。另外，研究发现肠伤寒沙门氏菌鼠伤寒血清型（S. enterica serovar Typhimurium，一种胞内病原体）的个体在感染细胞内分化为两个亚群：第一个表达T3SS基因但似乎繁殖不良，而第二个不表达T3SS基因但繁殖旺盛。重要的是，第二个亚群的繁殖依赖于第一个亚群提供的T3SS效应物。这项研究突出了由T3SS效应物介导的两个遗传上无法区分的细菌亚群之间的细菌间合作，并暗示其功能分工可能类似于蜜蜂等真社会性昆虫所进行的劳动分工。

这一点被另一项近期研究进一步佐证。这些作者令人信服地证明，在感染宿主组织（植物胞外空间）中，油菜假单胞菌油菜致病型个体以时间上和空间上协调的方式分化为T3E产生亚群和鞭毛产生亚群。T3E产生个体在定殖位点早期占主导地位，而鞭毛产生个体随着感染进展而获得优势，并聚集在感染焦点的周边。作者总结道："由表达T3SS的细菌产生的效应物充当'共同物品'来抑制免疫，使运动的鞭毛表达细菌能够增殖并在组织坏死前离开感染组织。"

群体感应

我们接下来讨论群体感应（QS）作为同种细菌间合作的第二个实例。QS在自由生活（浮游）细菌群体和宿主组织内部均能运作。QS可发生在由同一细菌物种/菌株/分离株的近缘个体组成的群体中，也可发生在由多个物种个体组成的群体中。但我们的讨论仍然仅涉及同种QS。同种个体之间的QS使它们能够监控周围环境中同伴的密度，并相应调整其行为，以同步表达和/或抑制某些对细菌生存和繁殖至关重要的产物。QS被认为在协调许多，如果不是大多数细菌的社会行为中起着至关重要的作用，在易受宿主防御、捕食者、营养匮乏或其他环境敌意的微栖息地中最大化细菌适应性。

QS在细菌基因组中编码为复杂系统，包含指导QS信号分子（又称自诱导物）合成和分泌的基因，以及识别和响应自诱导物的同源受体。机会性病原体铜绿假单胞菌专门分配至少十余个基因共同组成三个相互关联的QS系统，称为Las、Rhl和PQS系统，产生如N-(3-氧代十二酰)-L-高丝氨酸内酯（3O-C12-HSL）、N-丁酰-L-高丝氨酸内酯和2-烷基-4-喹诺酮等小型分泌化合物作为自诱导物。这些自诱导物的感知进而调控高达10%的铜绿假单胞菌基因的表达。鉴于自诱导物是细菌定殖位点中的公共物品，QS系统基因中的LOFM使相应的突变细菌成为欺骗者。例如，铜绿假单胞菌ΔlasI突变体，虽然缺乏自诱导物合成酶LasI，但仍能识别和响应同伴产生的自诱导物，以在与同种细菌共享的定殖位点中最大化其自身适应性。相反，更为常见的ΔlasR突变体缺乏自诱导物感知蛋白LasR，从而消除了重新编程群体行为所需的转录激活事件。两类欺骗者都必须及时清除，以最大限度减少群体范围内各种破坏QS基因的欺骗突变的积累，并防止其叠加。

生物膜

生物膜是我们感兴趣的同种细菌间合作的第三个实例。生物膜是一种复杂结构，其中多种形式的细菌间合作同时发生。它是一种微观庇护所，保护驻留细菌免受不利环境和杀菌剂（如抗生素、宿主防御化合物和免疫细胞）的影响。生物膜可由液体中的细菌形成，也可在固体表面（如水管内部、医疗检查设备）形成；或形成于患者组织中，如齿龈接缝处、皮肤烧伤处或手术植入物。复杂的生物膜可容纳不同细菌物种，但我们的关注点仍然是由同一细菌物种、菌株或分离株个体组成的生物膜。同种生物膜通过大量细菌个体的合作行为组装而成，它们共同分泌或释放胞外多聚物质（EPS），包括多糖、蛋白质、脂质和DNA。重要的是，生物膜内的细菌已被证明可分化为执行高度专业化任务的亚群。相当大比例的细菌个体甚至经历自溶性自杀，以为生物膜提供保护性EPS，使正在繁殖的同伴受益。因此，生物膜的构建是数百至数千个细菌个体之间精心组织的社会协调的一种形式。可以很容易地看出，这种社会性非常有利于欺骗者，因此需要严格的反欺骗监控。

合作焦点处的瓶颈式繁殖假说

BRFC假说认为，共定殖特定位点（焦点）的同种细菌个体之间的合作并不会为所有合作个体提供均等的适应性益处。相反，BRFC宣称合作焦点处的大多数合作个体被瓶颈排除在增殖性细胞分裂（繁殖）之外，仅允许极少数（少至一个）个体随机逃脱瓶颈以追求有意义的繁殖。因此，少数瓶颈逃脱者成为极少数高度扩增的克隆后代谱系的创始者。由此，对于一个合作的细菌细胞单元（焦点）而言，合作焦点同时也是瓶颈式繁殖的焦点。

为避免可能的混淆，我们希望阐明两个关键点。第一，"合作焦点"一词描述的是可明确观察到同种细菌个体之间合作的最小合作单元。它可以是通过此类合作在患者体内建立的微小病灶，或是生物膜内的一个微菌落（后文详述）。第二，虽然瓶颈逃脱仅由极少数合作个体实现，但其他一些个体进行极其有限繁殖的可能性与该假说不矛盾。然而，与增殖性繁殖的瓶颈逃脱者的后代数量相比，由此类有限繁殖产生的后代数量应可忽略不计。

图1是BRFC排列形式之一的简化描绘，以铜绿假单胞菌生物膜内的微菌落为例。

在有利于生物膜形成的培养基中，铜绿假单胞菌细胞（图示为短杆状）会相互聚集，形成微小的凸起（图1，步骤1，生物膜草坪）。这些小凸起可进一步发展为更高的团块，称为微菌落（步骤2），最终成熟为高耸的蘑菇状土丘（步骤3）。这些蘑菇状土丘的顶端已知会释放具运动性的细菌细胞，这些细胞会扩散至新位置（步骤4）。BRFC假说预测，微菌落的形成与成熟过程是由极少数协作细菌个体的瓶颈式繁殖所驱动的。在图1A的步骤2中，深灰色卵形细胞簇表示由单个深灰色创始细胞启动的瓶颈式繁殖，而底部的杆状细胞表示提供公共物品但被排斥在繁殖之外的协作细胞。图1B描绘了类似的轨迹，只是放大的细胞簇现在源自单个浅灰色创始细胞。随着微菌落的生长，其他协作个体可能会经历有限的、局部化的繁殖，产生小片的后代细胞，分别由图1A或图1B中蘑菇状土丘颈部附近表示的浅色或深灰色细胞簇代表（步骤3，左侧）。在这种瓶颈式排列中，罕见的搭便车细胞（以红色短杆表示）大多数时候无法产生后代。换言之，瓶颈式繁殖大多数时候将大多数搭便车者排斥在繁殖之外（图1A）。尽管如此，由于瓶颈逃逸是随机事件，搭便车者偶尔会突破瓶颈，放大后代细胞从而主导土丘顶端，并从该处释放扩散细胞（图1B，步骤4）。然而，如果这种情况发生，搭便车者扩散的后代——所有都携带相同的搭便车突变——将集体迁移并到达同一新位点尝试重新定殖。这很可能会失败，因为所有（或大多数）共同到达的个体携带相同的搭便车突变，它们之间无法实现协作互补。无法协作定殖新位点将导致搭便车者在新位点的繁殖失败，从而将底层搭便车突变从未来群体中清除。

图1：BRFC在铜绿假单胞菌生物膜中的示意图

短杆状表示协作的、不进行分裂的细胞，它们相互协作以促进表面定殖；而小椭圆形表示由瓶颈式繁殖产生的后代细胞。由于不可避免的DNA复制错误，生物膜创始细胞预计几乎相同但仍有微小差异，以深灰色、浅灰色和白色表示，尽管这些差异对协作行为影响甚微。相反，红色短杆表示携带LOFM（社会性基因功能丧失突变）的突变体个体，该突变敲除了其中一个社会性基因。在情景（A）下，由单个深灰色细胞启动的通过二分裂进行的瓶颈式繁殖产生微菌落（步骤2），然后形成蘑菇状土丘（步骤3）。随着蘑菇状土丘向上生长，其他创始细胞偶尔可能启动局部瓶颈式繁殖，形成各自的谱系簇（以蘑菇颈部左侧的浅灰色簇表示）。然而，由于它们在空间上与顶端隔离，这些后代细胞几乎没有机会参与新定殖位点的新一轮瓶颈式繁殖。相比之下，在顶端通过瓶颈式繁殖产生的后代细胞——深灰色——才是主导扩散群体的那些。在情景（B）下，蘑菇状土丘的大部分由浅灰色创始细胞的瓶颈式繁殖形成。然而，顶端恰好被突变体创始细胞的后代占据。扩散时，所有后代细胞在同一协作任务上失败，因此在新定殖位点几乎没有成功的机会。注意，可能还存在其他中间情景，其中两个或多个后代谱系混合，允许在临时基础上发生生物膜级别的搭便车行为。然而，这些搭便车者将通过在后续定殖位点反复进行瓶颈式繁殖而被排斥。

我们急于指出，虽然在这个简化模型（图1）中只有一个协作个体留下后代，但BRFC假说确实允许多个个体突破瓶颈产生迁移后代的场景。然而，鉴于瓶颈逃逸事件的随机性，在后续几个定殖周期中反复进行BRFC很可能足以进一步富集搭便车者谱系并使其暴露于纯化选择之下。另一方面，临时保留社会搭便车者在某些情况下可能是有益的，例如通过调节公共物品的局部浓度以避免过度生产。

人们还可以进一步推测，BRFC排列可能遗传编码在大多数甚至所有细菌基因组中，且这种排列可能由自然选择所保留。但这如何实现？要回答这个问题，最好设想一个BRFC未发生或被突变击败的协作细菌群体。在这种情况下，社会性基因功能丧失突变（SG LOFMs）将持续出现，敲除越来越多的社会性基因。此外，由于丧失的协作功能可由共同定殖的亲缘个体互补，携带社会性LOFM的个体将继续以与野生型同类相似甚至更高的速率繁殖。这种情况的持续将使社会性LOFMs的多样性和频率升至削弱相应细菌群体严谨性的水平，原因是公共物品的长期短缺。当达到一定阈值时，通过自发突变恢复/发明BRFC的细菌个体将有望建立能更一致且高效地清除搭便车者的群体，从而胜过缺乏BRFC功能的群体。这些新群体将受到自然选择的青睐。

BRFC是否有实验证据支持？

BRFC假说与许多已发表研究的发现一致。例如，一些细菌个体已知会自我牺牲以贡献生物膜构建所需的EPS（胞外多糖）及其他材料，从而将自己排斥在繁殖之外。铜绿假单胞菌在生物膜内也被观察到分化成功能各异的功能亚群，其中一些亚群不太可能参与繁殖。一些细菌，如肺炎链球菌和单核细胞李斯特菌，会促使一部分协作细胞自溶释放细菌素和毒素以抑制宿主免疫，同时牺牲自身留下后代的机会。

BRFC假说还与通过含有不同比例野生型个体和携带社会性基因LOFM突变体的细菌群体混合感染所获得的观察一致。Czechowska等人观察到，携带缺陷型T3SS（III型分泌系统）的突变体细菌在感染铜绿假单胞菌的患者中频繁被分离。这些突变体在混合感染动物中经常胜过野生型细菌。然而，当突变体细菌占主导地位时，这种竞争优势会减弱。令人惊讶的是，如果没有与野生型细菌混合，这些突变体完全无法感染易感宿主（小鼠）。这一最后的观察与BRFC完全一致，因为它证明了搭便车者一旦与协作的亲缘个体隔离就会被迅速抑制。用自然选择的术语来说，这种隔离迫使搭便车者表达条件致死表型，并使这种条件致死性暴露于纯化选择之下。我们应重申，由于搭便车者必须在与协作亲缘个体隔离之前才能表达搭便车者表型（条件致死性），这种隔离只能通过瓶颈式繁殖来一致实现。

Klausen等人提供了对BRFC更直接的支持。这些作者通过对铜绿假单胞菌（分离株PAO1）构建两个同基因谱系——分别标记黄色和青色荧光蛋白（Yfp和Cfp）——来获得支持证据。他们随后以1:1的比例混合两种菌株，在称为流室装置的设备中诱导生物膜，以便通过共聚焦显微镜观察。诱导的生物膜最初表现为同时含有Yfp标记和Cfp标记细胞的草坪。随后，小型多细胞微菌落从生物膜草坪中涌现。值得注意的是，这些微菌落中的细胞要么是Yfp标记的，要么是Cfp标记的，但从未同时是两者。由于初始生物膜草坪含有几乎均匀混合的两种同基因细胞，作者得出结论认为，每个微菌落必定源自单个创始细胞的增殖性繁殖。换言之，周围存在的多个诱导生物膜的细胞中只有一个有机会繁殖成多细胞微菌落。因此，这些微菌落源自生物膜环境中的瓶颈式繁殖。

这些微菌落最终发展为离散的蘑菇状土丘。显然，随着蘑菇状土丘高度上升，一些不分裂的细胞随之迁移。这是因为在由不同荧光标记主导的蘑菇状土丘的侧面或顶端也观察到了携带另一种荧光标记的小型细胞簇（图1）。同样，这些局部细胞簇含有携带Yfp或Cfp标记的细胞，但不会同时是两者。因此，它们也是各自位置的局部瓶颈式繁殖的产物。

这些蘑菇状土丘中的繁殖瓶颈化在扩散步骤得到了进一步强化（图1）。蘑菇状土丘被认为用于将放大的个体扩散至新定殖位点。研究表明，铜绿假单胞菌诱导的蘑菇状土丘顶端附近的许多细胞最终经历受控自溶形成空腔，从中推动位于顶端中心的细胞——已知为游泳细胞——扩散出去。这表明，尽管在蘑菇状土丘的多个位置可能发生有限的瓶颈式繁殖，但只有顶端中心的克隆后代才有机会在新定殖位点进一步繁殖。

BRFC假说还得到了最近一项研究感染动物中细菌群体动力学的支持。这些作者构建了一个由2,764个可互相区分的同基因变体组成的肺炎链球菌群体，每个变体通过独特的染色体条形码加以区分。他们随后利用这个群体定殖幼鼠的鼻咽部。他们发现"接种后1天内，多样性减少超过35倍，单一克隆谱系扩张。"更重要的是，作者发现这种多样性的急剧丧失不能由相对克隆丰度、遗传漂变或体内适应来解释，从而表明瓶颈式繁殖可能是其原因。有趣的是，尽管肺炎链球菌是缺乏T3SS的革兰氏阳性菌，但肺炎链球菌个体已被证明向胞外空间分泌大量毒力因子以确保成功定殖。更引人注目的是，与生物膜中居住的铜绿假单胞菌类似，许多肺炎链球菌个体也进行自杀性自溶以释放效应因子，帮助其他个体存活和繁殖。

最后，虽然许多研究者观察到了细菌群体瓶颈，尤其在使用条形码群体接种动物模型时，但这些研究者几乎一致地将瓶颈解释为源于宿主的限制因素，如物理性血脑屏障或宿主免疫系统的杀伤。相比之下，我们的BRFC假说认为，这些瓶颈更好地由编码在细菌基因组中的BRFC排列来解释，并在需要细菌间协作的宿主体内环境中被激活。

BRFC的可能机制

协作的细菌个体如何相互协调以执行BRFC？更具体地说，这种协调如何使大多数参与个体无法产生后代？我们可以预见两种过度简化的情景。首先，如果协作的细菌个体共同分泌一种或多种抑制性群体感应自身诱导物，在适当局部浓度下禁止附近细胞的分裂，则可能发生繁殖瓶颈化（图2A中的黄色球体）。因此，偶然位于协作焦点外围的细胞可能遇到较低浓度的此类群体感应自身诱导物，从而摆脱抑制开始繁殖（图2A）。

图2：BRFC的可能机制

（A）协作焦点（左侧）由不进行分裂的细菌个体（灰色短杆）占据，它们共同产生一种抑制性群体感应自身诱导物，以从中心向周缘浓度渐降的黄色球体表示。因此，大多数细胞被限制在不繁殖状态。偶尔位于周缘的细胞（以右下方的灰色短杆表示）遇到足够低浓度的群体感应自身诱导物，从而从抑制中释放，产生大量后代细胞（右图灰色椭圆形）。

（B）该协作焦点（左侧）由共同产生促进自杀性群体感应自身诱导物的细菌个体（红色球体）占据。

因此，聚焦中心的细胞大多发生自杀，导致局部QS浓度下降（中心）。这反过来使得偶尔存活的细胞（中间图中心处的灰色棒状物）得以繁殖并形成后代谱系（右侧）。虽然生长抑制活性尚未与任何已知的QS自诱导物相关联，但有一些间接证据支持这一观点。例如，*P. aeruginosa* Δ*lasI*突变体不再产生QS自诱导物3O-C12-HSL，在营养丰富的培养基中（该培养基预计不会激活QS），其生长速率远高于野生型对照，表明即使是基础水平的3O-C12-HSL也能抑制野生型*P. aeruginosa*的生长。与此推测一致的是，在培养基中补充3O-C12-HSL后，Δ*lasI*突变体的加速生长现象被消除。此外，在*E. coli*中表达具有功能的LasI蛋白可显著抑制*E. coli*在营养丰富的培养基中的生长。虽然这些观察结果此前被解释为与自诱导物合成相关的适应性代价，但它们也可能反映了某些自诱导物额外的生长抑制作用。

另一种可能但并非互斥的机制是，某些QS自诱导物在足够高的浓度阈值下可能诱导细胞自溶解（图2B左侧的红色球体）。这些细胞的溶解反过来会减少能够分泌致死性QS自诱导物的活细胞数量。因此，致死性QS自诱导物的浓度会逐渐降低（图2B中间），使得少数随机存活的细胞能够不受阻碍地开始繁殖。与此情景一致的是，Aggarwal及其同事证明，从*Spn*中删除*blp*基因座导致瓶颈放松，使接种后一天从感染小鼠中可回收的条形码克隆多样性增加了5倍。*blp*基因座编码多种细菌素肽，这些肽介导对邻近细菌细胞的杀伤。此外，已知*blp*基因座基因的表达由QS信号肽BlpC诱导。相应地，删除*blpC*基因同样导致感染小鼠中克隆多样性的显著提高。另外，*P. aeruginosa*也被发现会释放一种致死性QS自诱导物，称为HQNO，该物质通过干扰电子传递反应来触发自溶解。综合这些发现，强烈表明生物膜和宿主内定植位点的瓶颈繁殖需要QS。相反，QS本身的完整性很可能也依赖于通过瓶颈繁殖进行的严格监视。

BRFC排列可能解释其他制服搭便车者的策略

其他作者提出了细菌可能采用的几种监督细菌间合作中搭便车者的策略。其中最突出的包括亲缘选择、频率依赖选择、空间结构和搭便车者杀伤。在此，我们将推测这些策略与BRFC排列之间的关系。

**亲缘选择**

亲缘选择是首先用于解释人类和动物中利他行为的理论框架。它规定，如果执行利他行为的个体的亲属（亲缘）能直接从这些行为中受益，从而繁殖更多携带利他基因的后代，那么利他性状就能在种群中持续存在。亲缘选择理论得到了大量实验数据的支持，包括涉及细菌的研究。然而，在分子水平上仍然缺乏令人满意的解释。我们提出，亲缘选择及其支持性实验发现可以通过BRFC假说从机制上加以解释，因为BRFC排列能够产生亲缘选择所需的近亲关系，同时也解释了诸如细菌致死性自溶解等利他行为。

**频率依赖选择**

频率依赖选择认为，当细菌社会合作中的搭便车者上升到某一频率阈值时，就可以被清除，使其逃避合作的表型无法被合作同伴所庇护。这一理论基于将携带搭便车突变的突变体个体与其野生型同伴混合培养的研究观察。在真实世界的感染中，搭便车者谱系只能通过两种机制上升到足以使其表型暴露的频率阈值。第一种机制假设不存在BRFC。在这种情况下，当一个搭便车者谱系达到频率阈值时，许多其他搭便车者谱系也会达到类似的频率。它们一起会将底层的种群推向灭绝的边缘。第二种达到表型暴露频率阈值的机制是通过BRFC。在后一种情况下，搭便车者谱系的富集只是众多瓶颈事件中的一个，大多数此类事件会扩增具有合作能力的细菌谱系，从而在细菌种群中保持社会性。

**空间结构**

空间结构认为，生物膜或高粘度的局部环境等物理结构限制了公共物品的扩散，确保只有紧密相邻的高度相关细菌个体才能享受合作的益处。然而，这种空间结构无法解释如何处理紧密相关个体中新出现的搭便车者。此外，最近的报告表明，某些空间结构实际上可能通过促进种群分化为不同的定植策略来抑制合作。相比之下，我们的BRFC假说既能实现对新出现的搭便车者的持续清除，又能解释生物膜等空间结构的形成，即通过共同定植个体之间的合作行为。需要注意的是，被瓶颈排除在繁殖之外的个体并非处于惰性状态。相反，它们参与各种（往往是专门的）任务，如T3E的产生和分泌、QS自诱导物的生物合成、营养获取，甚至BRFC的执行。

**搭便车者杀伤**

搭便车者杀伤规定，合作细菌可以产生毒素（细菌素）来杀死搭便车者。虽然这可以解释杀死无法解毒驻留物种分泌的杀伤毒素的不同入侵物种，但无法解释仅相差一两个随机单基因座的同种搭便车者。例如，一个搭便车者个体可能在某个细菌素基因中携带功能丧失突变，但仍然产生相应的解毒酶。另一方面，在细菌共定植位点，协调的自溶解（自溶）非常常见，为生物膜构建提供材料，并为其他共居者提供能量来源。所有这些现象都可以用BRFC假说加以解释。

**如何检验BRFC假说？**

BRFC假说的优势在于，其预测可以利用现有的实验系统相对容易地进行检验。例如，BRFC预测，虽然许多*P. aeruginosa*个体在蘑菇丘发育过程中进行合作，但只有一两个能产生用于扩散的克隆后代。要检验这一预测，可以构建一个由100–200个同基因个体组成的条形码种群，并利用该种群编程生物膜发育。然后可以确定从每个蘑菇丘释放的扩散后代中能检索到多少独特条形码。反过来，Aggarwal及其同事的条形码*Spn*种群也可以用于重复动物接种实验。但是，与其对每只小鼠甚至不同组织或器官类型进行采样，不如解剖小鼠以识别感染小鼠器官或组织内的单个定植焦点，并确定从每个焦点中能回收多少独特条形码。类似地，Ruiz-Bedoya及其同事产生的*Pst* DC3000突变体面板，每个突变体仅产生36个T3E中的一个，可以以单焦点分辨率重新测试，以确定在每个定植焦点中有多少合作突变体进行了增殖性繁殖。

**结语**

我们提出BRFC假说以应对细菌单基因座中功能丧失突变的持续威胁，并倡导以合作焦点处的瓶颈繁殖作为自然选择方案来实时根除这些突变。简言之，在自然感染（繁殖）位点中，细菌在其生命周期的多个阶段频繁进行细胞间合作以确保存活和繁殖。事实上，许多细菌已知将数百个基因用于合作性状，如T3SS、分泌的毒素和效应物、QS以及生物膜发育。为应对监督单基因座功能丧失突变的挑战，我们认为社会性细菌很可能实践BRFC，阻断大多数合作个体的繁殖。结果是，少数逃逸瓶颈的个体的后代谱系将富集为极少的基因型，这些基因型可以在新的定植位点受到基于表型的自然选择的作用。例如，如果其中少数基因型之一携带使公共物品产生单基因座失去功能的功能丧失突变，新的定植位点就会缺乏相应的共享物品。无法建立新的定植位点反过来会将该突变从未来种群中消除。毫无疑问，BRFC假说需要通过理论建模和严格的实验审查来进一步发展。我们希望本文能引起对该假说的广泛兴趣，并激发对其预测的多方面检验。

**致谢**

我们感谢Michael Lynch博士对本文早期版本的批判性阅读。我们感谢Qu实验室成员进行的富有启发性的讨论。BRFC假说部分灵感来自于一个由NSF资助（#1758912）的项目研究成果。

**作者贡献**

概念化：F.Q.、K.K.和C.P.C.；原始撰写：F.Q.；撰写—审阅与编辑：F.Q.和K.K.；经费获取：F.Q.；资源：J.H.；监督：F.Q.

**利益声明**

作者声明不存在竞争利益。