环状DNA富集测序（CIDER-Seq）技术促进了与墨西哥莫雷洛斯州番茄曲叶病相关的新世界（NW）双生病毒-α卫星复合体的发现

《Viruses》：Circular DNA Enrichment Sequencing (CIDER-Seq) Facilitated the Discovery of a New World (NW) Begomovirus–Alphasatellite Complex Associated with Leaf Curl Disease of Tomato in Morelos, Mexico

　　

环状DNA富集测序（CIDER-Seq）方法鉴定出一个与墨西哥莫雷洛斯州采集的番茄曲叶病相关的新世界（NW）双生病毒-α卫星复合体。研究人员利用21个表现出病毒病相关症状的样本之一，CIDER-Seq数据揭示了多种NW双生病毒物种的存在，即Begomovirus solanumaureivariati（番茄金黄色花叶病毒：ToGMoV）、Begomovirus solanumseveri（番茄严重曲叶病毒：ToSLCV）和Begomovirus solanumlapazense（番茄奇诺拉巴斯病毒：ToChLPV）。此外，还鉴定出α卫星Whiflysatellite guatemalaense（粉虱相关危地马拉α卫星1：WfaGA1）和Clecrusatellite guatemalaense（粉虱相关危地马拉α卫星2：WfaGA2），证明双生病毒可与α卫星共侵染；然而，α卫星与辅助双生病毒之间关联的致病意义仍不完全清楚。基于PCR的检测和环状病毒基因组Sanger测序揭示了包含双生病毒-α卫星复合体所有组分的高频混合侵染检出率，证实了CIDER-Seq方法在产生高保真序列方面的可靠性。分子和生物学分析揭示了该复合体对番茄的适应性、ToSLCV/ToChLPV物种的单分体特性，以及这些双生病毒物种作为辅助病毒的能力。据研究人员所知，这是墨西哥首次报道与双生病毒-α卫星复合体相关的番茄曲叶病。

**研究背景与科学问题**

双生病毒科（Geminiviridae）是一类具有环状单链DNA（ssDNA）基因组的植物病毒，其基因组大小为2.5至5.2 kb，包裹在孪生的准二十面体颗粒中。该科根据寄主范围、昆虫媒介类型、基因组组织和系统发育关系划分为15个属。其中，双生病毒属（Begomovirus）成员由多食性粉虱（Bemisia tabaci）传播，已报道超过440个种，是影响全球热带和亚热带地区多种双子叶作物最具破坏性的双生病毒类群。双生病毒根据基因组系统发育特征分为旧世界（OW）和新世界（NW）两大类群。NW双生病毒多为双分体，具有DNA-A和DNA-B两个大小相似的基因组组分（2.6-2.8 kb），而多数OW双生病毒为单分体，其基因组组织类似双分体病毒的DNA-A，并额外编码一个与外壳蛋白部分重叠的V2开放阅读框（ORF）。双生病毒可伴随额外的环状ssDNA卫星分子，这些卫星分子需要辅助双生病毒完成细胞间移动、包装和粉虱传播。目前已描述三类DNA卫星：β卫星（仅存在于OW）、α卫星（在OW和NW中均有发现）和δ卫星（仅存在于NW）。尽管β卫星作为OW双生病毒引起的多种植物病害的致病性决定因子已被广泛描述，但α卫星与双生病毒相关的生物学效应仍知之甚少。在美洲，α卫星已在巴西和古巴的非栽培植物以及委内瑞拉的西瓜和巴西的番茄等作物中被检测到与NW双分体双生病毒相关，此外还通过载体宏基因组学（VEM）在危地马拉和波多黎各的带毒粉虱样本中被发现。值得注意的是，与OW双生病毒-α卫星关联不同，NWα卫星与不同NW双生病毒表现出广泛的互作，导致症状严重程度增加并干扰辅助病毒的传播。在墨西哥，多种双生病毒已与番茄曲叶病相关，但迄今为止尚无其与DNA卫星关联的报道。因此，开展相关研究对于揭示墨西哥番茄曲叶病的病毒复合体组成及流行学意义重大。

**研究内容与主要发现**

本研究利用环状DNA富集测序（CIDER-Seq）方法，结合PCR检测、Sanger测序、系统发育分析、调控元件分析和农杆菌介导的侵染性克隆接种试验，系统鉴定了墨西哥莫雷洛斯州番茄曲叶病相关的双生病毒-α卫星复合体。研究人员对2018年采集的21个表现病毒病相关症状的番茄样本进行检测，其中20个样本双生病毒PCR检测呈阳性。选取其中一个阳性样本（A20）进行CIDER-Seq分析，共获得16,326条高保真（Hi-Fi）读段，经过DeConCat算法去连环化后得到12,441条读段，大小主要集中在约2.7 kb区域。序列注释结果鉴定出三种NW双生病毒物种和一个包含两种α卫星的复合体。具体而言，ToGMoV的DNA-A和DNA-B分别占49.63%和20.20%的读段，与参考序列的一致性分别为97.09%和97.30%；ToSLCV和ToChLPV分别占28.52%和0.05%的读段，与对应DNA-A的一致性分别为97.65%和97.32%，但未鉴定到其对应的DNA-B；α卫星WfaGA1和WfaGA2分别占0.22%和0.27%的读段，与最相似序列的一致性分别为94.26%和94.12%。此外，0.85%的读段被归类为来源于番茄基因组的推定环状分子，包括RNA相关分子（tRNA、snRNA）、转座子（LTR、helitron、LINE）和假基因。通过Sanger测序获得的全长病毒基因组序列与PacBio一致性序列的相似性超过99.9%，验证了CIDER-Seq方法的准确性。PCR特异性检测显示，包含全部五种DNA病毒组分的复合侵染是最普遍的感染模式（43%），表明该复合体在田间条件下可稳定建立。

系统发育分析表明，ToGMoV、ToSLCV和ToChLPV归属于NW的Squash分支，与其他适应胡椒和番茄的NW双生病毒物种（如PepGMV、PHYVV和ToTLV）聚在一起。而WfaGA1和WfaGA2分别归属于Whiflysatellite属和Clecrusatellite属。调控元件分析揭示了三种双生病毒的重复序列（iteron）均呈现典型的NW排列方式，其重复序列相关结构域（IRD）和特异性决定子（SPD）的氨基酸残基与各自的iteron序列相容。α卫星WfaGA1和WfaGA2的iteron排列方式相同但共有序列不同，且SPD区域的生化组成存在差异，可能影响Rep-like蛋白与这些基序的相互作用。

生物学特性研究表明，ToSLCV和ToChLPV能够在没有同源DNA-B的情况下建立系统性感染，证实了其NW单分体特性。ToGMoV单侵染在14天接种植株表现出典型的双生病毒相关症状（叶卷曲和黄色斑驳），但在28天时症状完全消失，表现出寄主恢复表型。三重组（ToGMoV/ToSLCV/ToChLPV）混合接种在14天时表现出比重组更强的卷叶和黄化斑驳症状，提示混合侵染的协同效应。病毒基因组定量分析表明，在14天时，ToGMoV和ToChLPV单侵染的病毒基因组水平较高（约10⁸和10⁹基因组拷贝/微克总DNA），而ToSLCV水平较低（约10⁴）；三重侵染中所有三种病毒的基因组水平均显著下降约一个数量级，表明混合侵染中存在竞争效应。

辅助病毒鉴定试验表明，ToGMoV、ToSLCV和ToChLPV均可作为WfaGA1和WfaGA2的辅助病毒。然而，双生病毒与α卫星之间的互作效应因组合而异：ToGMoV与α卫星共接种表现为协同作用，其中ToGMoV/WfaGA2组合导致病毒基因组水平显著增加约一个数量级（从约10⁸升至约10⁹），症状严重程度也最高；而ToSLCV和ToChLPV与α卫星的共接种则表现为拮抗作用，病毒基因组水平显著降低约一个数量级。WfaGA1和WfaGA2均能在番茄植株中建立系统性感染，但其积累表现出随机分布特征。

**讨论与结论**

本研究首次在墨西哥报道了与番茄曲叶病相关的双生病毒-α卫星复合体，包含三种双生病毒（ToGMoV、ToSLCV和ToChLPV）和两种α卫星（WfaGA1和WfaGA2）。研究结果表明，CIDER-Seq方法能够准确鉴定病毒和卫星DNA组分，其产生的高保真序列与Sanger测序结果具有高度一致性（>99%），为植物病毒组学研究提供了可靠的技术手段。ToSLCV和ToChLPV的单分体特性得到了生物学验证，这两种病毒可以在缺少同源DNA-B的情况下系统侵染番茄植株，这为理解NW双生病毒的基因组进化和移动机制提供了新的视角。研究发现α卫星与双生病毒的互作效应具有组合特异性：与ToGMoV表现为协同作用，与ToSLCV/ToChLPV表现为拮抗作用，这一发现挑战了以往将α卫星效应简单归类的认知。该复合体中ToSLCV和ToChLPV可能从危地马拉等中美洲国家传入墨西哥，而ToChLPV可能为墨西哥地方性物种，提示植物贸易和带毒粉虱媒介可能促进了双生病毒-α卫星复合体的传播扩散。该研究扩展了对墨西哥番茄曲叶病相关DNA病毒因子的认识，强调了应用NGS工具实施基于病毒组学的流行病学和生态学探索策略的重要性，对制定有效的病害防控策略具有重要参考价值。