SARS-CoV-2核衣壳蛋白中单克隆抗体N179识别的保守线性表位的鉴定

《Viruses》：Identification of a Conserved Linear Epitope in SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein Recognized by Monoclonal Antibody N179

　　

摘要
研究人员先前制备了针对SARS-CoV-2核衣壳（N）蛋白的小鼠单克隆抗体N179，并开发了一种基于胶体金的免疫层析检测试纸条，其检测限为2 ng/mL，与RT-qPCR的一致性为98%。然而，N179所识别的精确表位此前尚不明确。研究人员利用GST融合N蛋白截短片段、Western印迹和ELISA，将该线性抗体反应区域定位至N蛋白的C末端尾部，并在所用截短作图条件下确定390QTVTLL₃₉₅为最小反应区域。对11条代表性SARS-CoV-2 N蛋白序列进行的多序列比对显示，该基序在所分析的序列中完全保守。EMBOSS WATER分析进一步表明，仅在SARS-CoV-2中存在完美的6/6匹配；在其他六种人冠状病毒、四种流感病毒和五种蝙蝠冠状病毒中均未发现相同序列。计算结构分析预测该区域可能具有表面可及性，且全部六个残基均超过BepiPred 3.0的默认阈值。这些发现确定390QTVTLL₃₉₅为截短作图所定义的最小反应区域，并表明该序列在所分析的代表性SARS-CoV-2谱系中保守。结合序列比较和结构预测，这些结果为解释此前观察到的N179识别谱提供了序列水平的信息。该基序可作为选择与评估靶向SARS-CoV-2 N蛋白保守区域的诊断抗体的参考。

**论文解读：单克隆抗体N179识别SARS-CoV-2核衣壳蛋白保守线性表位的鉴定与结构预测**

**一、研究背景与科学问题**

SARS-CoV-2的持续流行对快速、准确的诊断检测提出了长期需求。逆转录定量PCR（RT-qPCR）作为参考标准，其应用受限于专业实验室设施和训练有素的人员，难以在即时检测和大规模筛查中推广。基于侧向流免疫层析的抗原快速诊断检测（Ag-RDTs）因其操作简便、周转时间短和成本低而成为实用替代方案。SARS-CoV-2核衣壳（N）蛋白作为四种主要结构蛋白之一，在病毒颗粒和感染细胞中含量丰富、免疫原性强、可在呼吸道标本中检测到，且在各病毒谱系中相对保守，因此成为抗原检测的主要靶标。然而，SARS-CoV-2变异株的持续出现对抗体依赖的诊断检测方法的可靠性构成威胁。N蛋白中的突变，特别是位于抗体识别表位内的突变，可削弱甚至完全消除抗体结合，导致假阴性结果。例如，B.1.429变异株中的D399N替代显著损害了Quidel Sofia SARS抗原FIA检测的性能，表明单个氨基酸替代即可影响诊断灵敏度。因此，鉴定和表征识别N蛋白中高度保守线性表位的单克隆抗体具有重要的科学和临床应用价值。

研究人员此前已制备了针对SARS-CoV-2 N蛋白的小鼠单克隆抗体N179，并开发了检测限为2 ng/mL、与RT-qPCR结果一致性达98%的胶体金免疫层析检测试纸条。然而，N179识别的精确表位此前尚不明确。本研究旨在解决以下问题：该抗体反应区域是否在代表性SARS-CoV-2谱系中保守？其序列与选定的相关呼吸道病毒对应区域有何差异？哪些预测的分子特征可能与N179识别相关？这些问题的回答将有助于从表位水平理解N179的识别机制，评价该基序的保守性和序列特异性，并为基于N179的检测方法此前观察到的特异性谱提供序列水平的解释。该论文发表在《Viruses》期刊。

**二、主要技术方法**

本研究使用了以下关键技术方法：（1）重组蛋白表达与纯化：利用pET-28a(+)-CorN质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达His标签重组N蛋白，通过?KTA系统配合HisTrap Excel亲和层析柱纯化；（2）GST融合截短蛋白构建与表达：基于SARS-CoV-2参考基因组（GenBank登录号NC_045512.2）设计引物，构建pGEX-4T-3载体表达近全长N蛋白片段（3–419 aa）及系列C端截短片段，经GST亲和层析纯化；（3）表位作图：通过Western印迹和ELISA检测各截短片段与mAb N179的反应性，ELISA阳性判定阈值为阴性蛋白对照平均OD450值的2.1倍；（4）序列检索与多序列比对：从NCBI GenBank数据库获取11条代表性SARS-CoV-2 N蛋白序列及七种人冠状病毒、四种流感病毒和五种蝙蝠冠状病毒的N或NP氨基酸序列，使用KEGG ClustalW进行多序列比对并以ESPript 3.2可视化，同时使用EMBOSS WATER（PAM30矩阵，gap开放罚分10，延伸罚分0.5）进行严格局部双序列比对；（5）结构预测：使用PSIPRED预测二级结构，ProtScale（Kyte-Doolittle疏水性标度）评估疏水性，BepiPred 3.0评价线性B细胞表位倾向性，AlphaFold预测全长N蛋白结构模型（UniProt登录号P0DTC9）用于表面暴露分析，并提取残基390–395的pLDDT分数。

**三、研究结果**

**3.1 mAb N179对重组N蛋白识别的验证**

研究人员表达并纯化了His标签重组N蛋白（CorN），SDS-PAGE分析显示在约50 kDa处出现明显蛋白条带，与CorN预期分子量一致，且主要存在于上清组分中，表明CorN以可溶性蛋白形式表达。Western印迹证实mAb N179特异性识别纯化的CorN，在预期分子量处产生单一免疫反应条带，确认了N179与重组N蛋白的结合特异性。

**3.2 截短作图将残基390–395确定为mAb N179识别的最小反应区域**

研究人员表达了一系列GST融合N蛋白片段。Western印迹显示，mAb N179识别近全长N蛋白片段（3–419 aa）及C端片段287–419 aa和388–419 aa，但不与N端片段（3–98 aa）或中央区域片段（99–194 aa和177–304 aa）反应，初步将表位定位至C端区域（388–419 aa）。进一步截短表明，388–396 aa片段保留反应性，而397–405 aa、392–405 aa和392–401 aa片段无可检测免疫反应性，将反应区域缩小至残基388–396。逐残基截短分析显示，删除395位亮氨酸（L395）或390位谷氨酰胺（Q390）即消除免疫反应性。因此，在本截短作图条件下，390QTVTLL₃₉₅是保留mAb N179可检测反应性的最小片段。ELISA定量验证与Western印迹结果一致，含完整QTVTLL基序的390–395 aa片段被一致判定为阳性，而389–394 aa和391–395 aa片段的信号与阴性蛋白对照相当。三个独立ELISA实验的阳性/阴性分类结果完全一致，证实了截短作图结果的可重复性。

**3.3 QTVTLL区域在分析的代表性SARS-CoV-2谱系中保守**

多序列比对显示，390QTVTLL₃₉₅在所分析的11条SARS-CoV-2序列中完全保守，包括Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron BA.1-BA.4、JN.1和XBB谱系。NCBI BLAST搜索未在检索到的SARS-CoV-2序列中发现QTVTLL基序内的天然氨基酸替代。相比之下，在所检查的15条非SARS-CoV-2核蛋白序列中未鉴定到完全匹配的QTVTLL序列。SARS-CoV Tor2和蝙蝠冠状病毒BM48-31分别含PTVTLL和ATVTLL，与SARS-CoV-2 QTVTLL序列仅差一个残基，显示5/6一致性；其余病毒的最佳局部比对仅显示2或3个相同残基（33.3–50.0%一致性）。此前研究中N179检测系统与流感病毒和其他人冠状病毒无阳性交叉反应信号，与本研究序列比较结果一致，支持N179识别的高度特异性。

**3.4 QTVTLL区域被预测位于N蛋白柔性C端区域内**

结构预测分析表明，QTVTLL表位位于N蛋白C端柔性区域内，该区域预测缺乏规则二级结构，位于C端二聚化结构域下游。二级结构分析显示该片段主要采用无规卷曲构象；Kyte-Doolittle疏水性分析表明其具有亲水性特征，与潜在表面暴露一致。ScanProsite结构域注释将QTVTLL区域置于注释的N端RNA结合结构域和C端二聚化结构域（CTD）之外。BepiPred 3.0对各残基的评分分别为：Q390为0.1908、T391为0.1791、V392为0.1791、T393为0.1662、L394为0.1598、L395为0.1515，全部六个残基均超过默认阈值0.1512，但L395的评分仅略高于阈值。AlphaFold pLDDT分数显示六个残基均低于50（平均值27.01），表明该C端区域预测局部构象的置信度极低。因此，AlphaFold模型仅用于提供残基390–395在C端区域内位置的一般结构背景，而QTVTLL区域的具体局部构象和表面可及性不能仅凭AlphaFold模型可靠推断，这些结构发现应视为预测性结果而非表位可及性的实验证明。

**四、讨论要点与研究结论**

讨论部分指出，本研究确定了390QTVTLL₃₉₅为本截短作图条件下mAb N179识别的最小反应区域，将N179反应序列从宽泛的C端区域缩小至六残基基序，为解释N179胶体金免疫层析试纸条此前的性能提供了序列水平信息。诊断相关性在于，抗体依赖性抗原检测的性能取决于实际抗体结合位点的稳定性，而非仅取决于靶抗原的整体保守性。N蛋白中D399N和R203M等特异性替代已被报道可损害抗原检测灵敏度。预测的结构特征与QTVTLL区域潜在可及性一致，但未在实验上证明其可及性。该区域位于结构化C端二聚化结构域下游的柔性C端尾部内，预测的柔性可能与该短线性区域被mAb N179识别相容。此前的线性B细胞表位研究在该区域鉴定出401DFSKQLQQ₄₀₈和393TLLPAADLDDFSKQL₄₀₇等表位，长度为8–15个残基，与本研究鉴定的基序部分重叠或相邻；390QTVTLL₃₉₅代表当前截短作图条件下保留mAb N179可检测反应性的最小六残基线性区域。保守性分析显示该基序在11条代表性序列中完全保守，但分析并非穷尽性，不能确立绝对保守性。序列比较显示完整的6/6匹配仅在SARS-CoV-2中检测到，但序列差异不应等同于实验证明的抗体交叉反应性缺失。研究局限性包括：截短作图策略无法确定单个残基的贡献或评估依赖天然三维结构的构象决定因素；N179-表位复合物未经结构解析；结合动力学未定量；基序内残基水平贡献未通过丙氨酸扫描或定点突变验证；对SARS-CoV Tor2的PTVTLL和蝙蝠冠状病毒BM48-31的ATVTLL序列未进行实验性交叉反应性检测。

研究结论：本研究确定390QTVTLL₃₉₅为本截短作图条件下mAb N179识别的最小反应区域。该序列在所分析的11条代表性SARS-CoV-2 N蛋白序列中完全保守，在所选非SARS-CoV-2病毒中未鉴定到相同六残基序列。计算分析预测该区域位于柔性C端片段内，但其局部构象和表面可及性有待实验确定。这些发现为理解N179识别提供了序列水平信息，支持QTVTLL区域作为靶向SARS-CoV-2 N蛋白诊断抗体进一步评估的候选参考序列。更广泛的序列监测、定量结合测量、残基水平突变分析和实验性交叉反应测试将有助于确定N179的突变耐受性和诊断稳健性。