FASN介导的从头脂生成（de novo lipogenesis）会促进神经酰胺（ceramide）的积累，并导致心律失常性心肌病（arrhythmogenic cardiomyopathy）中的心肌损伤

《iScience》：FASN-mediated de novo lipogenesis promotes ceramide accumulation and myocardial damage in arrhythmogenic cardiomyopathy

　　亮点
- 在心房颤动（ACM）心肌细胞中，由FASN驱动的从头脂肪生成被上调
- 核内膜蛋白JUP与SREBP1合作促进FASN的转录
- FASN产生的神经酰胺会促进心肌细胞凋亡和心肌损伤
- 用奥利司他抑制FASN可以改善ACM小鼠的心脏功能和生存率

摘要
心房颤动性心肌病（ACM）是一种由连接蛋白基因突变引起的遗传性疾病，其特征是进行性心肌丧失和纤维脂肪替代。本研究显示，从头脂肪生成的关键酶脂肪酸合成酶（FASN）在ACM患者的心肌细胞以及一种特异性Dsg2突变小鼠模型中的心肌细胞中表达上调。连接蛋白功能障碍导致联结斑蛋白（JUP）向细胞核转移，JUP与SREBP1合作激活FASN的转录。由此产生的从头脂肪生成使葡萄糖转向合成脂毒性神经酰胺，从而促进心肌细胞凋亡，这一点通过同位素追踪、脂质组学和RNA测序得到证实。用奥利司他进行药物抑制FASN可减少心肌脂质积累、细胞凋亡和纤维化，改善心脏功能和生存率。这些发现定义了JUP/SREBP1/FASN轴，将连接蛋白功能障碍与心肌脂毒性联系起来，并确定FASN作为ACM的治疗靶点。

图形摘要
心房颤动性心肌病（ACM）是一种主要由于连接蛋白基因突变引起的心肌病，其特征是进行性心肌丧失和纤维脂肪组织替代，可影响右心室或左心室或两者。据估计，ACM的患病率约为每2000人中有1例，全球患者人数接近300万。ACM带来重大健康风险，主要表现为危及生命的室性心律失常和突然心脏死亡；部分患者在晚期会出现心力衰竭。因此，ACM是年轻人突发心脏死亡的主要原因之一，是全球重要的健康问题。目前针对ACM的治疗方法有限。植入式心脏复律除颤器是目前预防ACM患者突发心脏死亡的唯一措施；然而，有效的药物干预或阻止ACM进展为心力衰竭的治疗方法尚缺乏。心脏移植仍是治疗晚期ACM导致的心力衰竭的唯一可行方法，但由于供体器官稀缺，大多数ACM患者无法接受这种治疗。因此，基于ACM病理机制开发能够抑制或潜在逆转其进展的药物至关重要。

当前共识认为，ACM的病因与连接蛋白基因突变有关。这些突变导致ACM的病理特征，即进行性心肌丧失和纤维脂肪替代，涉及双心室不同程度的影响。ACM研究的一个重要方面是阐明连接蛋白基因突变如何引发心肌细胞丧失和心室纤维脂肪组织替代的机制，以及确定潜在的干预靶点。Marian及其同事提出，在ACM中，联结斑蛋白（JUP）从连接蛋白上分离并转移到细胞核，在那里竞争性抑制β-连环蛋白/Wnt信号通路，从而促进脂肪生成。先前基于诱导多能干细胞（iPSC）的建模研究表明，PKP2突变心肌细胞通过PPAR-γ激活表现出过度的脂肪生成，但导致连接蛋白功能障碍与脂肪生成之间的上游代谢酶和具体转录机制仍不清楚。此外，这些研究未能充分解释为什么心室心肌容易出现纤维脂肪替代和心肌丧失，也未导致针对减少ACM心肌脂质积累的靶向药物干预措施的开发。越来越多的证据表明，神经酰胺（一类鞘脂）在多种心脏疾病中起因果作用，包括心力衰竭、缺血性心脏病和动脉粥样硬化。从机制上看，神经酰胺促进心肌细胞凋亡、诱导线粒体功能障碍并驱动不良的心肌重塑。在健康的心脏中，脂肪酸合成酶（FASN）的表达水平非常低，因为从头脂肪生成主要发生在肝脏和脂肪组织中。因此，心肌细胞中FASN的显著上调可能是病理性的。

在本研究中，我们观察到来自ACM患者心脏样本及其通过Dsg2点突变诱导的小鼠模型的心肌细胞中存在从头脂肪生成，这一过程由FASN介导。进一步发现，在ACM中，连接蛋白基因的突变以及JUP与SREBP1在细胞核中的合作激活并上调了FASN的表达。这种从头脂肪生成过程产生了脂毒性化合物（如神经酰胺），导致心肌损伤。我们的临床前研究表明，FASN可能是一个有前途的ACM治疗靶点。

结果
- 在人类ACM患者的心肌细胞中，FASN表达上调
为了研究ACM患者的心脏中是否发生从头脂肪生成，我们对人类ACM和非疾病对照（NC）心肌组织进行了串联质量标记（TMT）蛋白质组学分析。在脂质代谢相关蛋白中，从头脂肪生成的限速酶FASN在ACM样本中显著上调（图1A）。对仔细解剖的左心室（LV）和右心室（RV）心肌及脂肪组织的Western blot分析显示，FASN的上调仅限于心肌部分，脂肪组织中没有显著变化（图1B、1C和S1A–S1C）。值得注意的是，与NC相比，ACM患者的LV和RV心肌中FASN水平均升高。这种上调似乎是ACM特有的，因为在扩张型心肌病（DCM）和NC心脏之间没有观察到FASN表达的差异（图S1D和S1E）。

- 在Dsg2mut/mut小鼠的心肌中，FASN表达上调
为了研究FASN上调在ACM中的功能作用，我们生成了携带Dsg2 p.F536C突变的敲入小鼠模型（图S2A和S2B）。纯合子Dsg2mut/mut小鼠表现出进行性心脏表型。超声心动图显示从8周开始LV射血分数（LVEF）逐渐下降，到12周时达到心力衰竭水平（图2A和2B）。从4周开始，它们出现炎症浸润和纤维化，并随时间恶化（图2D、2E和2H–2I）。两个心室都显示出病理改变，尽管右心室的壁厚度下降更明显（图2G）和脂质积累更显著（图2F和2J）。TUNEL染色显示，与野生型（WT）同窝小鼠相比，突变小鼠的心脏中凋亡心肌细胞显著增加（图2K和2L）。Western blot分析显示，12周时Dsg2mut/mut小鼠的心脏中FASN蛋白水平明显高于WT同窝小鼠（图2M和2N）。这些数据表明，Dsg2突变导致FASN上调、心肌脂质积累、炎症和纤维化，重现了人类ACM的关键特征。

- JUP在细胞核中的转移与SREBP1合作激活FASN的转录
FASN的表达主要以转录水平调控。我们进行了qPCR实验，发现人类和Dsg2mut/mut小鼠心脏中的FASN转录本显著上调（图S3A和S3B），表明发生了转录激活。为了识别上游调控因子，我们设计了针对FASN启动子上游2000 bp区域的DNA探针，并进行了质谱蛋白质组学分析（图3A）。DNA pull-down结果显示JUP结合到ACM心脏的FASN启动子上（图3B），这一点通过pull-down材料的Western blot进一步验证（图S3D）。核-细胞质分级和免疫荧光显示Dsg2mut/mut小鼠中JUP的核转移增加（图3C–3E和S3C）。双荧光素报告基因实验确认，在HL-1细胞中JUP过表达增强了FASN启动子的活性（图3F和S3E）。

**结论**
这些发现揭示了连接蛋白功能障碍与心肌脂毒性之间的联系，并确定FASN作为ACM的治疗靶点。未来基于ACM病理机制的药物开发对于推进治疗策略至关重要。比例尺，50微米。(I) 每50个细胞核的PLA信号定量（n = 6）。××××p < 0.0001（学生t检验）。(J) 使用anti-JUP抗体在WT和Dsg2mut/mut心脏的染色质上进行ChIP-qPCR。qPCR引物针对FASN启动子中的SREBP1结合位点（?73至?42 bp）。数据为输入百分比（平均值 ± 标准误差，n = 3）。××××p < 0.001与WT IgG相比；ns，无显著性（双因素方差分析）。(K) 使用anti-SREBP1抗体对相同样本进行ChIP-qPCR。*p < 0.05与WT相比（双因素方差分析）。(L) 在转染了对照siRNA（siNC）或JUP siRNA（siJUP）的sh-Dsg2 HL-1细胞中进行SREBP1的ChIP-qPCR。JUP敲低减少了SREBP1的 occupancy。数据为输入百分比（n = 6）。×××p < 0.001（学生t检验）。(M) 在siNC或siJUP处理后的sh-Dsg2 HL-1细胞中通过qPCR测量FASN mRNA表达（n = 6）。××××××p < 0.0001（学生t检验）。由于JUP不是典型的转录因子，我们探讨了它是否与已知的FASN转录调节因子合作，包括SREBP1、ChREBP、LXRα和USF-1。蛋白质相互作用预测表明JUP与SREBP1的结合最强，这种相互作用涉及SREBP1的N端核进入区域（图3G）。Duolink邻近连接测定（PLAs）显示Dsg2mut/mut心脏中的JUP-SREBP1邻近性显著增加，而WT中则没有（图3H和3I）。为了确定JUP和SREBP1是否共同占据FASN启动子，我们进行了染色质免疫沉淀（ChIP）-qPCR。使用anti-JUP抗体，我们观察到Dsg2mut/mut小鼠的FASN启动子中SREBP1结合位点（?73至?42 bp）的JUP occupancy显著升高（图3J）。使用anti-SREBP1抗体，我们发现Dsg2mut/mut心脏中同一区域的SREBP1结合也增加了（图3K）。为了进一步解析分子机制，我们使用慢病毒短发夹RNA（shRNA）建立了Dsg2敲低HL-1细胞系（sh-Dsg2），该细胞系的Dsg2表达减少了约90%（图S3F和S3G）。重要的是，在Dsg2缺陷的HL-1细胞中敲低JUP减少了SREBP1的 occupancy（图3L）并降低了FASN mRNA表达（图3M），这表明JUP有助于SREBP1的有效招募和FASN的激活。这些发现共同表明，桥粒功能障碍促进了JUP的核转运，其中JUP促进了SREBP1与FASN启动子的结合，从而驱动了ACM中的从头脂质生成。FASN在ACM中通过将底物（如葡萄糖）转化为棕榈酸来促进从头脂质生成，棕榈酸随后用于形成其他脂肪酸。为了研究ACM中FASN的上调是否可以在体内驱动从头脂质生成，我们采用了13C-葡萄糖同位素追踪方法（图4A）。分析了脂质合成级联中的关键中间体，包括丙酮酸、酰基-CoA和丙二酰-CoA（图4B），作为这一生物合成途径中的重要底物。同位素追踪后，从WT和Dsg2mut/mut小鼠的心脏中提取代谢物，并通过质谱测量这些代谢物的丰度和同位素富集（图4C–4E）。与WT相比，Dsg2mut/mut心脏中的13C标记的丙酮酸、酰基-CoA和丙二酰-CoA水平显著升高，表明从头脂质生成途径的通量增加了。这些数据表明，ACM中FASN的上调促进了心肌中葡萄糖向脂肪酸前体的转化。图4 同位素追踪显示Dsg2mut/mut小鼠心脏中的从头脂质生成显示完整标题图查看器(A) 通过颈静脉导管进行13C-葡萄糖输注的示意图。(B) 简化的代谢途径，说明葡萄糖转化为丙酮酸、酰基-CoA、丙二酰-CoA及下游脂肪酸的过程。(C–E) 通过质谱法量化野生型（WT）和Dsg2mut/mut小鼠心脏中13C标记（红色）和未标记（蓝色）的丙酮酸（C）、酰基-CoA（D）和丙二酰-CoA（E）（每种基因型n = 5）。数据为平均值 ± 标准误差。?p < 0.05, ??p < 0.01, ???p < 0.001（学生t检验）。从头脂质生成诱导的神经酰胺介导心肌损伤ACM心肌组织的脂质组学分析显示出与非疾病对照组（NC）相比的显著差异，其中神经酰胺种类的变化最为明显（图5A、5B和S4）。为了确定这些神经酰胺是否来自从头合成的脂肪酸，我们在Dsg2mut/mut小鼠中进行了13C-葡萄糖同位素追踪。Dsg2mut/mut心脏中的总神经酰胺水平和13C-葡萄糖的神经酰胺整合都显著增加（图5C和5D）。RNA测序（RNA-seq）和基因本体论（GO）富集分析显示Dsg2mut/mut心脏中参与神经酰胺合成和脂质运输的基因上调（图S5），表明转录激活促进了神经酰胺的积累。图5 过量的神经酰胺在从头合成脂质后触发心肌细胞死亡显示完整标题图查看器(A) 人类ACM和非疾病对照组（NC）心肌的脂质组学数据热图（每组n = 5）。数据经过对数2转换并进行了Z评分。(B) 脂质种类的火山图；上调的脂质用红色突出显示。(C) 简化的途径图，说明葡萄糖转化为神经酰胺的过程。(D) 13C-葡萄糖同位素追踪：Dsg2mut/mut与野生型（WT）心脏中13C标记神经酰胺的相对丰度（n = 5）。?p < 0.05（学生t检验）。(E) 在HL-1 sh-NC和sh-Dsg2细胞中进行Sptlc2的qPCR（n = 3）。××××××p < 0.0001（学生t检验）。(F) 通过LC-MS/MS测量的sh-NC与sh-Dsg2细胞中神经酰胺的相对丰度（n = 3）。?p < 0.05（学生t检验）。(G) 血清剥夺和针对SPTLC1/2的siRNA的实验设计。(H) 在指定组中验证Sptlc2敲低效率的qPCR（n = 3）。××××××p < 0.0001（单因素方差分析，使用Tukey检验）。(I) 在(G)中显示的组中通过annexin V/碘化丙啶（PI）流式细胞术量化凋亡（n = 3）。×××p < 0.01；ns，无显著性（单因素方差分析，使用Tukey检验）。(J) 通过LC-MS/MS测量的sh-NC与sh-Dsg2细胞中神经酰胺的相对丰度（n = 3）。××××××p < 0.001（学生t检验）。(K) 在相同条件下对sh-NC、sh-Dsg2、sh-Dsg2 + myriocin和sh-Dsg2 + myriocin + C16-ceramide的annexin V/PI凋亡分析（n = 4）。××××××p < 0.01, ?×××p < 0.001（单因素方差分析，使用Tukey检验）。(L) 在(I)相同条件下对切割的caspase-3和GAPDH的Western blot。(M) 在(K)中的组中对切割的caspase-3和GAPDH的Western blot。数据为平均值 ± 标准误差。?p < 0.05, ??p < 0.01, ?×××p < 0.001, ?××××××p < 0.0001；ns，无显著性。为了直接研究神经酰胺在心肌细胞损伤中的作用，我们使用了sh-Dsg2 HL-1细胞系（图S3F和S3G）。这些细胞表现出神经酰胺合成酶Sptlc2的上调（图5E）和神经酰胺水平的升高（图5F）。在血清剥夺条件下，sh-Dsg2细胞显示出增强的凋亡，这种凋亡通过小干扰RNA（siRNA）介导的Sptlc1/2敲低显著减少（图5G–5I）。为了进一步确定因果关系，我们用myriocin处理sh-Dsg2细胞，myriocin是一种神经酰胺合成的药物抑制剂。Myriocin降低了神经酰胺水平和凋亡，这种效果通过添加外源性C16-ceramide部分逆转（图5J和5K）。一致地，切割的caspase-3水平也呈现相同模式（图5L和5M）。这些结果表明，FASN介导的头头脂质生成下游的神经酰胺产生直接导致心肌细胞凋亡。为了探讨ACM中神经酰胺积累的临床相关性，我们对ACM患者及其健康亲属的血浆样本进行了探索性分析（表S3）。脂质组学显示，经历过重大不良心血管事件（MACE）的ACM患者血浆中的神经酰胺浓度显著高于没有MACE的ACM患者和健康亲属（图S6A）。单变量分析的森林图表明血浆神经酰胺水平与MACE相关（图S6B）。FASN可能是ACM的治疗靶点为了研究FASN是否可以作为ACM的治疗靶点，我们用临床已建立的FASN抑制剂orlistat或安慰剂处理6周大的Dsg2mut/mut小鼠（图6A）。Orlistat治疗显著提高了Dsg2mut/mut小鼠的存活率（图6B）。超声心动图评估显示，orlistat防止了安慰剂处理的突变体中观察到的LVEF和 fractional shortening（FS）的进行性下降，并且还减少了RV扩张（图6C和6H–6J）。这些功能改善伴随着心肌脂滴积累的显著减少（图6F）、更少的凋亡细胞（图6G和6M）以及炎症浸润的减少（图6E和6L）在orlistat处理的Dsg2mut/mut心脏中。Masson三色染色显示心肌纤维化显著减少（图6D和6K）。总体而言，这些数据表明FASN的药物治疗可以减轻ACM的关键病理特征，从而保护心脏功能。图6 FASN是ACM的潜在治疗靶点显示完整标题图查看器(A) 实验时间线：6周大的Dsg2mut/mut小鼠及其同窝野生型（WT）对照组每天接受腹腔注射FASN抑制剂orlistat或安慰剂，持续6周。(B) Kaplan-Meier生存曲线（n = 10 WT + 安慰剂，10 WT + orlistat，25 Dsg2mut/mut + 安慰剂，22 Dsg2mut/mut + orlistat）。××××××p < 0.01（对数秩检验）。(C) 12周时左心的代表性B模式和M模式超声心动图。(D) 心脏切片的Masson三色染色。比例尺，1毫米。(E) 心脏切片的苏木精和伊红（H&E）染色。比例尺，1毫米。(F) 心脏切片的油红O染色。比例尺，50微米。(G) 心脏切片的TUNEL染色。比例尺，50微米。(H–J) 左心室射血分数（LVEF，%）(H)、fractional shortening（FS，%）(I) 和右心室面积（RV面积，平方毫米）(J)（每组n = 15）。××××××p < 0.0001（双因素方差分析，使用Holm-?ídák检验）。(K) 通过Masson三色染色量化纤维化面积（%）（每组n = 6）。××××××p < 0.001（双因素方差分析，使用Holm-?ídák检验）。(L) 通过H&E染色量化炎症浸润面积（%）（每组n = 6）。××××××p < 0.001（双因素方差分析，使用Holm-?ídák检验）。(M) 每视野中TUNEL阳性细胞的量化（n = 6）。××××××p < 0.001（双因素方差分析，使用Holm-?ídák检验）。WT + 安慰剂组和WT + orlistat组在所有参数上没有差异；仅显示Dsg2mut/mut组之间的比较。鉴于危及生命的心律失常是ACM的主要临床表现，我们接下来检查了orlistat治疗是否改善心脏电生理学。在6周治疗方案后，对分离出的小鼠心脏进行了体外光学映射（图6A）。在窦性心律期间，Dsg2mut/mut心脏经常表现出早期后除极（EADs），这是自发性室性心动过速的前兆（图7B，上）。Orlistat治疗显著降低了EADs的发生率（图7B，下）。等时激活映射和激活持续时间映射用于量化动作电位持续时间（APD）和传导速度（图7A）。与安慰剂相比，orlistat处理的Dsg2mut/mut心脏在100毫秒的起搏周期长度下显示出更快的传导速度（图7C）。此外，orlistat在80%和50%复极化时缩短了APD，但在20%复极化时没有（图7D–7F）。增强的传导速度和缩短的APD与降低的心律失常风险一致。这些发现表明，FASN的抑制不仅阻止了结构恶化，还改善了ACM小鼠的电稳定性。综上所述，我们的结果支持FASN靶点是一个有前景的ACM治疗策略。图7 药物学FASN抑制改善了ACM心脏的电生理异常显示完整标题图查看器(A) 在100毫秒起搏周期长度下，WT + 安慰剂、Dsg2mut/mut + 安慰剂和Dsg2mut/mut + orlistat组的代表性等时激活图和动作电位持续时间（APD）图。(B) Dsg2mut/mut + 安慰剂（上图）和Dsg2mut/mut + orlistat（下图）的代表性心电图（ECGs）。箭头指示早期后除极（EADs）。(C) 在100毫秒起搏周期长度下量化传导速度（n = 6组）。××××××p < 0.01（单因素方差分析，使用Tukey的多重比较检验）。(D–F) 在160毫秒起搏周期长度下量化80%（APD80，D）、50%（APD50，E）和20%（APD20，F）复极化时的动作电位持续时间（n = 6组）。?p < 0.05，?×××p < 0.01与Dsg2mut/mut + 安慰剂相比（单因素方差分析，使用Tukey的多重比较检验）。数据为平均值 ± 标准误差。讨论ACM是一种由桥粒基因突变引起的高度复杂的心肌疾病。其病理特征包括桥粒基因突变、纤维脂肪替代、心肌丢失和对致命性心律失常的易感性。先前的研究集中在ACM中脂肪细胞的起源上，提出了诸如心肌细胞转分化或心外膜前体分化等机制。虽然这些假设提供了关于脂肪组织来源的见解，但它们并未直接确定可治疗的目标。在这项研究中，我们发现FASN（一种在新脂肪生成中起关键作用的酶）在ACM（Arrhythmogenic Cardiomyopathy）心肌中的表达上调。我们研究了FASN表达增加的机制，并发现JUP与FASN启动子结合并激活了FASN的转录，这一点通过DNA pull-down和双荧光素酶报告基因实验得到了证实。进一步的实验，包括蛋白质相互作用预测、Duolink PLA和ChIP-qPCR分析，表明JUP与SREBP1相互作用并增强了其转录活性，从而导致FASN的表达上调。这些发现提示了桥粒功能障碍与脂肪酸合成增加之间的关联。利用13C-葡萄糖同位素追踪技术在Dsg2mut/mut小鼠中观察到葡萄糖转化为脂肪酸的过程。因此，我们的数据表明，在ACM心脏中积累的脂质有很大一部分来源于心肌细胞内的新脂肪生成。

接下来，我们研究了脂肪生成与心肌丢失之间的关系。同位素追踪和RNA测序显示，脂质积累伴随着参与神经酰胺合成的酶的转录激活，进而导致脂毒性神经酰胺水平的升高。在Dsg2缺陷的HL-1细胞中，我们发现神经酰胺合酶的表达上调，而抑制神经酰胺的形成可以减少血清缺乏诱导的细胞凋亡。此外，使用myriocin药理学抑制神经酰胺合成可以减少细胞凋亡，而这种效果部分可以通过外源性C16-神经酰胺逆转，这支持了神经酰胺的因果作用。由于这些体外细胞凋亡实验是在血清缺乏条件下进行的，因此应将其视为一种应激放大的体外模型，而不是体内心肌细胞自发死亡的直接证据。综合这些结果，我们认为新脂肪生成和随后的神经酰胺产生促进了ACM中的心肌细胞死亡。

结合这些发现，我们提出了一个模型：桥粒基因突变促进了JUP向细胞核的转移，JUP与SREBP1合作上调FASN的表达。FASN介导的新脂肪生成导致脂质积累和脂毒性物质的生成，从而引起心肌丢失和其他病理特征。该模型可能有助于解释一些临床和病理观察结果。首先，尽管ACM现在被认为是一种双心室疾病，但右心室往往表现出更明显的脂质积累。这种右心室的相对优势可能反映了右心室心肌的能量需求较低，这可能促进了脂质积累和神经酰胺的产生，最终导致心肌损伤。其次，高达75%的ACM病例中存在炎症浸润。脂毒性物质（如甘油三酯和神经酰胺）可能在促进促炎基因的表达中起重要作用，从而导致炎症细胞浸润和纤维化。实际上，我们的RNA测序数据显示Dsg2mut/mut心脏中纤维化相关基因的表达上调，而orlistat治疗显著减少了胶原蛋白的沉积，这表明抑制FASN可以减轻ACM病理的脂肪性和纤维化成分。

最后，我们探讨了FASN抑制剂orlistat在Dsg2mut/mut小鼠中的治疗潜力。orlistat治疗显著改善了心脏结构、收缩功能、电生理学表现和生存率。这些数据表明，FASN抑制可能是治疗ACM的一种有希望的策略。

**研究的局限性** 需要承认几个局限性。首先，我们的研究主要基于Dsg2突变小鼠模型和Dsg2缺陷的HL-1细胞。虽然我们在少数具有PKP2或DSP突变的ACM患者中观察到了FASN的表达上调（图1A和表S1），但需要在其他桥粒突变模型（例如PKP2或DSP敲除）中进行直接的机制验证。其次，将JUP与SREBP1招募和FASN激活联系起来的证据是在HL-1细胞中获得的，尚未在体内得到证实；此外，我们的研究缺乏强有力的实验证据（如共免疫沉淀）来证明JUP和SREBP1之间的直接物理相互作用。我们主要使用了Duolink PLA和ChIP-qPCR，这些技术表明了功能上的邻近性和转录上的协作，但不等同于直接的结合测定。未来的研究需要确认它们的物理关联。第三，在我们的研究中，orlistat是全身给药的；因此，我们无法排除可能对观察到的益处有贡献的体外效应。第四，血浆神经酰胺与MACE（Major Adverse Cardiovascular Events）之间的临床关联是观察性的和探索性的。需要更大规模的前瞻性研究来评估神经酰胺作为潜在生物标志物的作用。此外，我们的体内机制实验仅在小鼠雄性中进行了；因此，未能评估JUP/SREBP1/FASN轴的潜在性别特异性效应。最后，FASN抑制剂的治疗效果尚未在大型动物模型或ACM患者中进行测试。

**资源获取** 有关更多信息和资源及试剂的需求，请联系首席联系人Jiangping Song（[e-mail]）。

**材料获取** 本研究中生成的Dsg2mut/mut小鼠系和sh-Dsg2 HL-1细胞系可根据合理请求从首席联系人处获得。

**数据和代码获取**
- 本文报告的数据将应请求由首席联系人共享。
- 本文未报告原始代码。
- 重新分析本文报告的数据所需的任何额外信息也可向首席联系人请求获得。

**致谢** 本工作得到了国家自然科学基金（824B2010）、国家杰出青年科学基金（82125004）和北京自然科学基金（Z240015）的支持。

**作者贡献**
S.H.和J.S.构思并监督了整个项目。Z.L.和H.C.设计了研究并撰写了手稿。S.S.、J.Han、M.S.和X.C.收集了样本。Z.L.、T.Y.、Z.C.和J.Huang进行了病理学和分子生物学实验。H.C.协助了数据分析。

**利益声明** 作者声明没有竞争利益。

**写作过程中使用的人工智能和AI辅助技术** 作者使用DeepSeek进行了英语润色和校对。所有输出内容均经过作者审核、编辑并最终确定。

**STAR★ 方法**
**关键资源表**通过慢病毒转导含有针对小鼠Dsg2的shRNA（序列：5′-TCCGCAGATCAGAGAAGAA-3′）的sh-Dsg2，生成了一个稳定的Dsg2敲低HL-1细胞系（sh-Dsg2）。作为对照，使用了一个非靶向shRNA（sh-NC）。选择过程中使用了嘌呤霉素（2 μg/mL）。亲本HL-1细胞系直接从Sigma-Aldrich公司购买（目录号SCC065），并在收到后不超过5代时使用；该细胞系未在我们的实验室重新验证。通过确认Dsg2的敲低来验证sh-Dsg2和sh-NC衍生细胞系（图S3F和S3G）。所有细胞系在实验使用前均使用基于PCR的支原体检测试剂盒（Mycoplasma Rapid Detection Kit，目录号PB180525，Procell，武汉，中国）进行了支原体污染检测，并确认无污染。

**方法细节**
**蛋白质组学分析**
心肌组织（50 mg）在尿素缓冲液中裂解，用DTT还原，用碘乙酰胺烷基化，然后于37°C下用胰蛋白酶（Promega）消化过夜。来自4个无突变心脏的肽段被合并作为内参（总量200 μg）。样品用TMT试剂（Thermo Fisher）标记1小时，用5%羟胺淬灭，混合后通过UPLC 3000（Thermo Fisher）分离，随后进行LC-MS/MS分析。MS/MS谱在Proteome Discoverer 1.4软件中通过UniProt人类数据库进行搜索。蛋白质表达量相对于内参进行计算。

**心脏组织脂质组学**
冷冻组织（10 mg）在氯仿:甲醇:水（3:6:1, v/v/v）中匀浆，于4°C incubate 30分钟，然后通过加水和水相分离。收集有机相，用SpeedVac干燥，并储存在-80°C。脂质重新溶解后通过LC-MS/MS进行分析。沉淀物中的总蛋白质通过BCA测定法进行定量以进行标准化。

**血浆脂质组学**
向血浆中加入内标（Sph 17:1, d7-Cer d18:1/24:0, d7-Cer d18:1/15:0），然后用乙酸乙酯:异丙醇（2:8, v/v）提取。离心后，上清液在Jasper HPLC上通过ESI+模式与Sciex 4500 MD质谱仪进行分析，使用Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 × 100 mm, 1.7 μm）。离子源设置： Curtain gas 20, ion spray voltage 4500 V, gas 1和2分别为80和70。各类鞘脂的定量基于添加的内标进行。

**Western blotting**
组织或细胞在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Roche）的RIPA缓冲液（Beyotime #P0013B）中裂解。裂解液通过SDS-PAGE（8–15%凝胶，Beyotime）分离并转移到PVDF膜（0.22–0.45 μm，Millipore）上。膜在5%脱脂乳/TBST中封闭1小时，然后于4°C下与一抗孵育过夜，随后与HRP结合的二抗在25°C下孵育1小时。信号使用Western HRP底物（Millipore）和Tanon成像系统检测。抗体列表见关键资源表。

**免疫荧光和多重免疫染色**
石蜡包埋切片（4 μm）脱蜡、复水，并在压力锅中用1 mM EDTA（pH 9.0）进行抗原修复。封闭后（5% BSA, 15%山羊血清在PBS中），切片在4°C下与一抗孵育过夜。二抗为Alexa Fluor标记（Invitrogen）。核用DAPI染色。使用共聚焦显微镜（Leica Stellaris）获取图像。通过ImageJ测量α-actinin阳性区域的平均荧光强度并减去背景值来量化荧光强度。抗体列表见关键资源表。

**Oil Red O染色**
冷冻切片加热至室温，用Oil Red O工作溶液（3:2的储备液和稀释液混合物）染色10–20分钟，然后用染色清洗液冲洗，并用苏木精复染。使用光显微镜捕获图像。通过ImageJ测量Oil Red O阳性区域占总组织面积的百分比来量化（每组n = 6）。

**透射电子显微镜**
组织样本在4°C下用2.5%戊二醛/0.1 M钠丙二酸缓冲液固定，后固定、包埋并切片。超微结构用JEM-1400电子显微镜（JEOL）观察。

**TUNEL检测**
使用In Situ Cell Apoptosis Detection Kit I（Boster）按照制造商的协议检测心脏切片中的凋亡细胞。计算每个视野中TUNEL阳性核（绿色）的数量，并将其与总DAPI阳性核进行归一化。每张切片随机选择至少6个视野进行分析（每组n = 6）。

**RNA提取和qPCR**
使用Tritizol（Invitrogen）从组织或细胞中提取总RNA。使用Primescript RT-PCR Kit（Takara）合成cDNA。在7500HT系统上使用SYBR Green（Applied Biosystems）进行qPCR。Rpl13a作为内参。引物序列列在关键资源表中。

**DNA pull-down assay**
合成覆盖FASN转录起始位点上游?2000 bp区域的生物素化双链DNA探针。将WT和Dsg2mut/mut小鼠心脏的核提取物与探针和链霉亲和素-磁珠孵育。结合的蛋白质通过LC-MS/MS进行洗脱和鉴定。为了验证，洗脱的蛋白质用抗JUP抗体进行Western blot分析。

**核-胞质分离**
使用核和胞质提取试剂盒（Thermo Fisher）分离核和胞质组分。通过Western blot检测GAPDH（胞质）和Histone H3（核）的纯度。通过密度计对每个组分中的JUP进行定量，并相对于相应的标记物进行归一化。

**双荧光素报告基因实验**
HL-1细胞接种在24孔板上，并使用Lipofectamine 2000与含有FASN启动子或基本对照的萤火虫荧光素报告基因、Renilla荧光素对照以及JUP表达质粒或空载体共转染。24小时后，使用Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega）测量荧光素活性。萤火虫活性相对于Renilla进行归一化，结果表示为相对荧光素活性。

**Duolink proximity ligation assay (PLA)**
心肌切片（4 μm）用4% PFA固定，封闭后与抗JUP（MCE HY-P80683, 1:300）和抗SREBP1（Abcam ab313881, 1:200）孵育。根据制造商的协议使用Duolink In Situ Red Starter Kit Mouse/Rabbit（Sigma）进行PLA。使用荧光显微镜（Zeiss LSM880）在40倍放大倍数下获取图像，并使用ImageJ计算每50个核的PLA信号。

**ChIP-qPCR**
使用ChIP Assay Kit（Cell Signaling #9003）进行染色质免疫沉淀。简而言之，细胞或组织先用1%甲醛交联，超声处理成200–700 bp片段，然后用抗JUP（Invitrogen 13–8500）或抗SREBP1（Abcam ab313881）或对照IgG进行免疫沉淀。纯化的DNA使用覆盖FASN启动子SREBP1结合位点（?73至?42 bp）的引物进行qPCR（见关键资源表）。

**siRNA和shRNA**
为了敲低JUP，使用Lipofectamine RNAiMAX将sh-Dsg2 HL-1细胞转染50 nM针对小鼠JUP的siRNA（siJUP, Dharmacon ON-TARGETplus smart pool）或对照siRNA（siNC）。48小时后通过Western blot评估敲低效率。为了敲低SPTLC1/2，细胞分别转染siSPTLC1和siSPTLC2（各25 nM）或siNC。通过qPCR确认敲低效果。

**Myriocin和ceramide rescue实验**
sh-Dsg2 HL-1细胞预先用myriocin（10 μM）处理48小时，然后在有无myriocin的情况下进行24小时的血清剥夺。为了恢复，加入与0.5% BSA复合物的C16-ceramide（10 μM）与血清剥夺一起。通过Annexin V/PI流式细胞术测量凋亡。通过LC-MS/MS量化ceramide水平。

**流式细胞术**
细胞收获后用PBS洗涤，并按照制造商的说明使用Annexin V-FITC和Propidium Iodide（PI）染色。样品在FACSCanto II流式细胞仪（BD）上分析。凋亡细胞定义为Annexin V阳性（早期和晚期）和PI阴性（早期）或PI阳性（晚期）。数据使用FlowJo v10处理。

**RNA-seq**
从WT和Dsg2mut/mut小鼠的心脏中提取总RNA（n = 4）。使用QIASeq Stranded RNA Kit制备文库，并在Illumina NovaSeq 6000上进行测序（双端，150 bp）。原始读段用STAR（v2.7）修剪并对齐到GRCm38/mm10基因组。使用RSEM（v1.3.1）量化基因表达。使用DESeq2（FDR <0.05, |log2FC| ≥ 0.585）分析差异表达。使用clusterProfiler（v4.4）和FDR截止值0.05进行GO富集分析。

**体内同位素追踪（13C-葡萄糖）**
在输注前三天，将导管植入WT和Dsg2mut/mut小鼠的右颈静脉。禁食12小时后，以0.1 μL min?1·g?1的速率输注13C-葡萄糖（均匀标记，99原子%）3小时。收集心脏，快速冷冻并研磨。代谢物在甲醇:乙腈:水（40:40:20, 0.5%甲酸）中提取，并使用HILIC分离技术在Q-Exactive Orbitrap上进行LC-MS分析。标记和未标记的丙酮酸、酰基-CoA和ceramide被量化。

**超声心动图和光学成像**
使用Vevo 2100系统（VisualSonics）对清醒的小鼠进行经胸超声心动图检查。测量LVEF、FS和RV面积。为了体外光学成像，心脏在Langendorff装置上逆行灌注Tyrode溶液，然后用电压敏感染料RH237（0.05 mg/50 mL）染色，并用MiCAM05 Ultima-L CMOS相机成像。以100 ms和160 ms的周期长度进行起搏。使用MATLAB Rhythm 2.0软件分析传导速度和APD80/50/20。

**组织学和纤维化量化**
心脏在4% PFA中固定，包埋在石蜡中并切片（4 μm）。使用标准协议进行H&E和Masson’s trichrome染色。使用ImageJ将Masson染色中的纤维化面积（蓝色）量化为占总切片面积的百分比。

**所有数据以平均值±SEM表示。统计分析使用GraphPad Prism 9.5.0进行。对于两组比较，使用未配对的t检验（如果方差不等则应用Welch校正）。对于多组比较，使用单因素或双因素ANOVA，然后根据图例指示进行事后Tukey或Holm-?ídák检验。p值<0.05被认为是统计显著的。具体的p值在图中用星号显示（?p < 0.05, ??p < 0.01, ??p < 0.001, ???p < 0.0001；ns，不显著）。每个图例中指明了生物学重复次数（n）；在适当的情况下注明技术重复次数。没有使用统计方法预先确定样本大小，但样本大小的选择基于该领域的先前经验。在可行的情况下应用随机化和盲法。**

**补充信息（1）**
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文档S1。图S1–S6和表S1–S3