《Life》：Renoprotective Effects of a Herbal Formulation Against Lipopolysaccharide-Induced Acute Kidney Injury Through Anti-Inflammatory and Antioxidant Activities
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脓毒症相关急性肾损伤（AKI）是一种严重的炎症性并发症，目前治疗选择有限。本研究探讨了台湾清冠一号（NRICM101）这一草药配方对脂多糖（LPS）诱导的AKI的保护作用。研究人员给雄性C57BL/6小鼠注射LPS以在体内诱导AKI，随后给予NRICM101治
脓毒症相关急性肾损伤（AKI）是一种严重的炎症性并发症，目前治疗选择有限。本研究探讨了台湾清冠一号（NRICM101）这一草药配方对脂多糖（LPS）诱导的AKI的保护作用。研究人员给雄性C57BL/6小鼠注射LPS以在体内诱导AKI，随后给予NRICM101治疗。在体外实验中，研究人员用LPS刺激NRK-52E肾上皮细胞以诱导炎症反应和氧化应激。通过高效液相色谱（HPLC）鉴定了关键生物活性成分，并使用分子对接进行分析。NRICM101显著改善了肾功能障碍，表现为血尿素氮（BUN）和血清肌酐（Scr）水平降低，并减轻了小鼠的组织病理学损伤。它有效抑制了促炎细胞因子的产生，减弱了细胞内和线粒体活性氧（ROS），并保持了线粒体膜电位。在机制上，NRICM101显著下调磷酸化p65（p-p65）、NOD样受体蛋白3（NLRP3）和裂解的caspase-1的表达，表明其调节了与肾性焦亡相关的核因子κB（NF-κB）/NLRP3炎症小体信号通路。分子对接预测了NRICM101来源的生物活性成分与Toll样受体4（TLR4）/MD-2复合物的潜在相互作用。综上所述，研究人员的研究结果表明，NRICM101通过抗炎和抗氧化作用改善LPS诱导的急性肾损伤，这些作用与调节NF-κB/NLRP3相关信号通路有关。
论文解读：台湾清冠一号（NRICM101）对脂多糖诱导急性肾损伤的保护作用及机制研究
**一、研究背景与目的**
脓毒症是一种由感染引起异常免疫反应而导致器官功能障碍的临床综合征，肾脏是其中最易受损的器官之一，约三分之一的脓毒症患者会并发急性肾损伤（acute kidney injury, AKI），即脓毒症相关AKI。脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）作为革兰氏阴性菌合成的关键分子，是诱导AKI的重要致病因素。LPS与Toll样受体4（toll-like receptor 4, TLR4）结合后，通过磷酸化p65亚基激活核因子κB（nuclear factor kappa-B, NF-κB），驱动炎症基因转录，促进肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha, TNF-α）和白细胞介素（interleukins, ILs）等细胞因子分泌，募集中性粒细胞和巨噬细胞至肾脏，增加活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生。同时，诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）衍生的一氧化氮（nitric oxide, NO）与ROS相互作用生成过氧亚硝酸盐，加剧氧化应激，导致抗氧化酶清除功效降低，进而诱发线粒体功能障碍，加重肾损伤。AKI以肾功能迅速下降为特征，表现为电解质和体液失衡、含氮废物蓄积及高发病率和死亡率，其诊断主要依据血清肌酐（serum creatinine, Scr）和血尿素氮（blood urea nitrogen, BUN）水平升高。焦亡（pyroptosis）作为一种炎性细胞坏死形式，在AKI肾小管上皮细胞损伤中发挥重要作用。NOD样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3, NLRP3）炎症小体的激活分为两步：第一步由NF-κB信号上调介导，增强NLRP3、pro-caspase-1及pro-IL-1β、pro-IL-18等促炎成分的转录；第二步由ROS、线粒体功能障碍和溶酶体破裂等信号触发，促进NLRP3炎症小体活化。活化后的caspase-1裂解pro-IL-1β和pro-IL-18为成熟形式，同时裂解gasdermin D（GSDMD），形成的膜孔道导致细胞因子释放、钾外流及细胞肿胀裂解。研究表明抑制焦亡可能是AKI的有效治疗策略。
台湾清冠一号（NRICM101）是一种包含黄芩、鱼腥草、桑叶、防风、瓜蒌、板蓝根、甘草、厚朴、薄荷和荆芥十味药材的复方制剂。已有证据表明NRICM101具有免疫调节、抗炎、抗氧化和神经保护活性。鉴于过度炎症和氧化应激是AKI的核心机制，研究人员推测NRICM101可能通过减轻这些病理过程发挥肾脏保护作用。然而，NRICM101在AKI中的治疗潜力和分子机制尚未阐明，且除透析支持外尚无有效疗法被证实可改善AKI。因此，本研究旨在评估NRICM101在AKI小鼠模型中的肾脏保护作用并探讨相关分子信号通路。
**二、主要技术方法**
研究人员采用的整体研究策略涵盖体内和体外两个层面。体内实验使用8周龄雄性C57BL/6小鼠（购自BioLASCO台湾有限公司），通过单次腹腔注射LPS（10 mg/kg，大肠杆菌O111:B4，Sigma-Aldrich）诱导AKI模型，4小时后分别以1、1.5和3 g/kg剂量口服灌胃给予NRICM101，24小时后处死动物收集血液和肾组织。体外实验使用大鼠肾小管上皮细胞系NRK-52E（购自美国典型培养物保藏中心），以LPS（1 μg/mL）联合三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP，5 mM）刺激24小时诱导损伤模型，NRICM101（0.5 mg/mL）在LPS暴露前30分钟给药。关键实验技术包括：苏木精-伊红（H&E）和过碘酸-雪夫（PAS）染色评估肾组织病理学改变；全自动生化分析仪检测BUN和Scr；逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测炎症和损伤相关基因mRNA表达；生化试剂盒检测抗氧化酶（SOD、过氧化氢酶、GPx）活性、脂质过氧化（MDA）、NO代谢产物硝酸盐及血清总抗氧化能力；免疫组织化学（IHC）和免疫荧光染色检测p-p65、NLRP3和cleaved caspase-1表达；MTT法检测细胞活力；LDH释放实验评估细胞损伤；FAM-VAD-FMK探针检测活化caspase-1；DHE、MitoSOX和TMRM荧光探针分别检测细胞内ROS、线粒体ROS和线粒体膜电位；高效液相色谱（HPLC）鉴定定量五种主要活性成分；分子对接分析NRICM101成分与TLR4/MD-2复合物（PDB ID: 3FXI）的结合模式。此外，使用NLRP3激动剂BMS-986299（10 μM，预处理1小时）验证NLRP3信号通路的参与。
**三、研究结果**
**3.1 NRICM101减轻LPS诱导AKI小鼠的病理损伤**
体内实验显示，LPS显著升高血清BUN和Scr水平，NRICM101剂量依赖性地抑制这些升高，表明肾功能改善。RT-qPCR结果显示，LPS显著增加肾损伤分子NGAL和KIM-1的mRNA表达，NRICM101显著减弱这些升高。H&E染色显示LPS诱导近端小管为主的急性肾小管损伤，表现为肾小管上皮肿胀、上皮完整性丧失、管腔内细胞碎片堆积和间质炎症细胞浸润；PAS染色显示LPS导致近端肾小管刷状缘明显破坏和消失，伴管腔内PAS阳性管型和细胞碎片积聚及上皮扁平化。NRICM101治疗显著减轻上述组织病理学改变，半定量肾小管损伤评分显著降低。
**3.2 NRICM101减轻LPS诱导AKI小鼠的炎症反应**
RT-qPCR分析显示，LPS显著上调肾脏促炎细胞因子基因TNF-α、IL-1β和IL-18的表达水平，同时增加PTGS2和NOS2的mRNA水平。NRICM101治疗显著降低这些炎症介质的表达上调，表明其具有抗炎作用。
**3.3 NRICM101减轻LPS诱导AKI小鼠的氧化应激**
LPS诱导显著的氧化应激，表现为脂质过氧化产物丙二醛（MDA）水平升高、NO水平增加以及肾脏抗氧化酶（SOD、过氧化氢酶和GPx）活性降低，同时血清总抗氧化能力显著下降。NRICM101治疗显著改善所有这些LPS诱导的改变，支持其抗氧化效应。
**3.4 NRICM101抑制LPS诱导AKI小鼠的焦亡相关信号**
免疫组织化学结果显示，LPS显著增加肾脏p-p65、NLRP3和cleaved caspase-1的蛋白表达水平，而NRICM101治疗显著抑制这些蛋白的升高，表明NRICM101调节AKI中与焦亡相关的信号通路。
**3.5 NRICM101保护NRK52E细胞抵抗LPS诱导的细胞毒性**
体外实验中，NRK52E细胞暴露于递增浓度的LPS（0.1-1 μg/mL）联合ATP（5 mM后，细胞活力随LPS浓度增加而进行性下降。NRICM101单独处理（0.125-0.5 mg/mL）不影响细胞活力；在LPS/ATP刺激细胞中，NRICM101浓度依赖性地恢复细胞活力，0.5 mg/mL浓度保护效果最佳。
**3.6 NRICM101减弱NRK52E细胞中NLRP3/caspase-1相关信号**
LPS刺激显著增加NRK52E细胞中TNF-α、IL-1β、IL-18、PTGS2、NOS2、NLRP3的mRNA表达以及NF-κB活化标志物p-p65的表达，NRICM101处理减弱了这些变化，表明其调节NF-κB/NLRP3相关信号通路。
**3.7 NRICM101减弱LPS处理NRK52E细胞中NLRP3/caspase-1相关信号**
LPS处理后细胞NLRP3表达显著升高，NRICM101处理使NLRP3表达维持在基线水平。NLRP3激动剂BMS-986299逆转了NRICM101对细胞活力恢复和caspase-1激活抑制的保护作用。NRICM101减少LPS/ATP诱导的LDH释放，而单独使用NRICM101不改变基础LDH释放；BMS-986299逆转了NRICM101对LDH释放的抑制效应，进一步支持NLRP3相关信号的参与。
**3.8 NRICM101减弱NRK52E细胞中与NLRP3信号相关的氧化应激和线粒体功能障碍**
NRICM101减少LPS诱导的细胞内和线粒体ROS产生，并保持线粒体膜电位。NLRP3激动剂BMS-986299逆转了这些效应，提示NLRP3信号有助于ROS生成，并参与NRICM101的线粒体保护作用。
**3.9 NRICM101生物活性成分鉴定**
HPLC分析定量了NRICM101冻干提取物中五种成分：汉黄芩素-7-O-葡萄糖醛酸苷（5.09 mg/g）、黄芩苷（27.36 mg/g）、甘草苷（0.38 mg/g）、木蝴蝶素A-7-O-葡萄糖醛酸苷（2.83 mg/g）和迷迭香酸（0.57 mg/g）。其中黄芩苷含量最高，支持其作为NRICM101制剂表征的代表性化学标记物。
**3.10 NRICM101成分与炎症相关靶点的分子对接分析**
分子对接结果显示，汉黄芩素-7-O-葡萄糖醛酸苷、黄芩苷、甘草苷、木蝴蝶素A-7-O-葡萄糖醛酸苷和迷迭香酸与TLR4/MD-2复合物中MD-2 LPS结合口袋的预测结合能分别为?8.34、?7.73、?8.08、?7.69和?7.63 kcal/mol，均低于?7.0 kcal/mol的阈值，提示这些成分可能与MD-2 LPS结合口袋发生相互作用。
**四、讨论与结论总结**
讨论部分指出，NRICM101在LPS暴露后给药仍能改善急性肾损伤，表现为肾功能改善、组织病理学改变减轻及炎症反应和氧化应激降低，这与许多在LPS暴露前给予干预的研究不同，具有临床转化意义。NRICM101显著减轻氧化应激的证据包括MDA和NO水平降低以及SOD、过氧化氢酶和GPx活性保持，并恢复血清总抗氧化能力。体外实验中NRICM101减少细胞内和线粒体ROS蓄积并保持线粒体膜电位，NLRP3激动剂BMS-986299逆转这些效应，提示NLRP3相关信号可能参与NRICM101的抗氧化和线粒体保护作用。HPLC分析显示黄芩苷是含量最丰富的成分，黄芩苷和汉黄芩素-7-O-葡萄糖醛酸苷作为黄芩根部的主要黄酮类成分具有抗炎和抗氧化活性。分子对接结果预测NRICM101成分可与TLR4/MD-2复合物相互作用，为抗炎效应提供潜在机制线索，但需进一步实验验证直接结合及其生物学相关性。
研究结论认为，NRICM101通过减少炎症反应和氧化应激以及保持线粒体功能，减轻了LPS诱导的急性肾损伤。这些保护效应可能涉及直接抗氧化活性和对NF-κB/NLRP3相关信号的调节。这些发现支持NRICM101对LPS诱导AKI的保护作用，但仍需进一步研究阐明其潜在分子机制和临床相关性。该论文发表在《Life》期刊。
