成年果蝇咽部和肠道感觉神经回路的连接组图谱

《iScience》：Connectomic mapping of pharyngeal and gut sensory circuits in adult Drosophila

　　

亮点
• 在果蝇脑连接组中鉴定出肠道（食管神经）感觉轴突及其亚群
• 咽部的味觉和机械感受神经轴突靶向不同的脑区
• 下游环路分析揭示了内部感觉轴突的主要脑区靶点
• 部分内部感觉轴突直接与运动神经元和内分泌神经元形成突触

摘要
进食行为同时受到外部感觉信号（如味觉）和源自咽部与肠道的内部感觉信号的调控。最近完成的成年雌果蝇全脑连接组（FAFB connectome）为全面描绘这些感觉通路及其下游环路提供了契机。虽然外部味觉受体神经元已被相对充分地研究，但咽部和肠道的内部感觉神经元仍然知之甚少。在此，我们系统性地鉴定了FAFB连接组中的咽部和肠道感觉轴突，并将其归类为不同的亚型。对它们下游环路的描绘揭示了这些内部感觉神经元所靶向的主要脑区。值得注意的是，其中一部分内部感觉神经元与运动神经元和内分泌细胞形成单突触连接，提示内部感觉信号可通过直接通路影响与进食相关的运动输出和内分泌功能。综上，我们的发现界定了咽部和肠道感觉环路，为未来研究内部感觉信号如何调控进食行为和内分泌功能奠定了基础。

图解摘要

引言
进食是动物最基本的行为之一，使它们能够获取营养和能量以支持其他生命活动。在许多动物中，包括脊椎动物和节肢动物，进食同时受到外部和内部感觉信号的调控。外部感觉信号，如嗅觉和味觉，帮助动物识别潜在的食物来源并评估其化学成分。味觉尤其重要，是进食过程中的一个关键检查点。例如，甜味表明糖类的存在，而糖类通常是营养物质，从而促进进食。苦味则警示动物毒素或有害化合物的存在，抑制进食。一旦进食开始，摄入的食物会继续被咽部和其余消化道中的化学感受器监测，提供食物消化后化学成分的相关信息。机械感受器也广泛存在于消化道中，提供关于摄入食物体积等信息。这些关于食物成分和体积的消化道内部感觉信号通过神经通路（如哺乳动物的迷走神经和脊神经）和体液通路（如肠道肽类）传至大脑，调节食欲和食物摄入。虽然许多外周感觉受体和通路已被研究，但中枢脑环路如何处理和整合外部与内部感觉信号以调控进食仍知之甚少。

果蝇（Drosophila melanogaster）是研究进食神经调控的重要模式生物。果蝇的味觉系统已被充分表征。与其哺乳类对应系统类似，果蝇将相关化学物质归为有限数量的味觉模态——包括糖类/甜味、苦味、水和咸味等——以指导进食决策。味觉感受器存在于外部和内部感觉器官及组织中，如唇瓣和足部（外部）以及咽部和肠道（内部），在不同进食阶段监测食物的化学成分。虽然外部味觉受体神经元（GRN）对进食的调控已得到广泛研究，但近期研究证明，位于咽部的内部GRN也在进食调控中发挥关键作用，它们能检测多种化合物——包括糖类、盐类、氨基酸和苦味物质——作为摄食的额外检查点。除GRN外，咽部还含有机械感受神经元，参与检测食物通过和调节吞咽动作。近期研究也开始探索肠道感觉信号如何传递至大脑以调控进食。一条关键通路涉及肠食道神经（StN），它起源于咽神经节（HCG）-心脏体（CC）区域，位于肠道前部附近。HCG中包含肠道感觉神经元，可检测糖类、钠盐和消化道机械扩张，并在进食调控中发挥多种作用。因此，果蝇是研究外部与内部感觉信号共同调控进食的优秀模型，这种策略在许多动物中普遍存在。

近期完成的多份连接组，包括雌果蝇全脑连接组（FAFB connectome）以及两性全中枢神经系统连接组，为描绘进食相关感觉神经元及其下游环路提供了令人振奋的机会。多项研究已表征了外部GRN并调查了其下游环路。然而，咽部和肠道的内部感觉神经元在连接组中仍未被完全描绘。在此，我们利用FAFB连接组，系统性地鉴定了进入咽下区域（SEZ）——果蝇大脑中主要进食控制中心——的内部感觉轴突。我们鉴定了源自StN的感觉轴突，StN将消化道传入信号传递至大脑。我们发现这些轴突包含多个亚型，具有不同的树突分支模式和突触后伙伴，提示存在功能特化。此外，我们鉴定了源自不同咽部感觉器官的感觉轴突，发现化学感受神经元和机械感受神经元投射至SEZ的不同区域。通过分析所鉴定肠道和咽部感觉神经元的下游环路，我们揭示了接收该感觉信息的主要神经突起。有趣的是，我们发现一些内部感觉神经元与多种运动神经元（MNs）和内分泌细胞形成直接突触连接，提示其活动可能直接影响进食相关的运动程序和内分泌功能。综上，本研究在果蝇脑连接组中鉴定了肠道和咽部感觉轴突并表征了其下游环路，为未来研究外部与内部感觉信号如何整合调控进食行为奠定了基础。

结果
在FAFB连接组中鉴定疑似肠道和咽部感觉轴突
果蝇脑的SEZ接收来自消化道及咽部内多个感觉器官的内部感觉投射。遵循近期研究，我们将SEZ定义为包括下颌神经节（GNG）、PRW、SAD、FLA和CAN神经突起（图S1）。

StN（在某些研究中也称为返行神经）沿食管背表面走行，包含约43条传入轴突，起源于靠近肠道前部的HCG-CC区域（表1）。HCG在某些研究中也称为食道神经节。（Singh、Mahishi和Huetteroth提供了StN及其入脑的有益解剖学示意图。）StN穿过食管孔后分为两支，向腹侧环行后分别与相应的咽神经（PhN）合并，再进入大脑。由于许多但不全部分叉，预计约少于86条StN轴突进入大脑。其轴突末梢分支至三叶脑区，大致对应Ito等人定义的PRW、FLA和GNG前部（图S1）。

表1：食管神经中的感觉轴突和咽部感觉神经元
| 起源 | 组成 | 经何处入脑 |
|------|------|-----------|
| 食道神经（StN） | 消化道，~43条感觉轴突（部分分叉） | PhN |
| 背唇腔感觉器官（DCSO） | 咽部，2×6味觉神经元 | PhN |
| 腹唇腔感觉器官（VCSO） | 咽部，2×8味觉神经元 | aPhN |
| 唇感觉器官（LSO） | 咽部，2×10味觉神经元；2×8机械感受神经元 | aPhN |
| 鱼篓刚毛 | 咽部，2×（~18–23）机械感受神经元 | aPhN |

咽部包含多个感觉器官，包括背唇腔感觉器官（DCSO）、腹唇腔感觉器官（VCSO）、唇感觉器官（LSO）以及两排鱼篓刚毛（也称卫星刚毛）。（Singh、Mahishi和Huetteroth提供了这些结构及其相关神经的有益解剖学示意图。）DCSO包含12个味觉神经元，VCSO包含16个味觉神经元，LSO包含20个味觉神经元和16个机械感受神经元，鱼篓刚毛包含约36–46个机械感受神经元（表1）。DCSO神经元经PhN投射入脑，而VCSO、LSO和鱼篓刚毛的神经元则经附属咽神经（aPhN）投射入脑（表1）。DCSO、VCSO和LSO的味觉神经元将轴突投射至SEZ背侧，主要位于PRW神经突起内（图S1）。咽部感觉器官中的机械感受神经元研究较少，其在脑中的轴突投射模式仍不甚清楚。

在FAFB连接组（FlyWire版本v783，可从Codex获取：https://codex.flywire.ai）中，PhN中有91条感觉轴突，aPhN中有85条感觉轴突（图1A–1B''）。aPhN轴突在FlyWire Codex中被分为两个亚类：第1组轴突（aPhN1，n = 33）分支于SEZ更背侧的区域，且全部分类为味觉类；第2组轴突（aPhN2，n = 52）分支于更腹侧的区域，该组中大多数神经元的感觉模态未知（图1B–1B''）。PhN轴突也包含两组：79条轴突形成一束，支配SEZ更前部的区域（图1A–1A''，绿色）；12条轴突形成另一束，支配更后部的区域（图1A–1A''，红色）。有趣的是，该束中全部12条PhN轴突在FlyWire Codex中均被分类为味觉类（类似于aPhN1轴突），它们支配的SEZ背侧区域（主要在PRW神经突起内）也与味觉aPhN1轴突支配的区域相同（图1C–1C''）。鉴于DCSO含有12个经PhN投射的味觉神经元，VCSO和LSO合计含有36个经aPhN投射的味觉神经元（表1），且其轴突分支于SEZ背侧，因此形成独立束的12条PhN轴突可能来自DCSO神经元（图1A–1A''和1C–1C''，红色），而33条aPhN1轴突可能来自VCSO和LSO味觉神经元（图1B–1B''和1C–1C''，黄色）。VCSO和LSO味觉神经元轴突数量的轻微不匹配（36对33）可能反映了个体发育差异或FlyWire中aPhN轴突亚类分类的不完善。其余79条PhN轴突可能起源于StN，与预期的StN轴突数量（n < 86）及其支配的脑区高度吻合（图1A–1A''，绿色）。最后，鉴于咽部感觉器官含有约52–62条经aPhN入脑的机械感受轴突（来自LSO和鱼篓刚毛，表1），52条aPhN2轴突可能来自这些咽部机械感受神经元（图1B–1B''，橙色），有待未来研究确认。

图1：在FAFB连接组中鉴定肠道和咽部感觉轴突
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（A–C''）咽神经（PhN）和附属咽神经（aPhN）中感觉轴突的前视图（左图）、背视图（中图）和侧视图（右图）。（A–A''）展示了StN和DCSO轴突的叠加；（A''）中的深灰色阴影表示PhN中的运动神经元。（B–B''）展示了aPhN1和aPhN2轴突的叠加。（C–C''）展示了aPhN1和DCSO轴突的叠加。所有图中，浅灰色阴影表示大脑。坐标轴表示脑的方位：A，前；D，背；L，侧。
（D）基于突触后伙伴余弦相似性的肠道和咽部感觉轴突聚类树状图。不同感觉群组标记如图所示。

除解剖学分析外，我们还调查了PhN和aPhN感觉轴突的输出连接。我们从连接组中检索了每条PhN或aPhN轴突的突触后伙伴，并利用余弦相似度对这些轴突的输出伙伴相似性进行聚类（详见STAR方法）。疑似DCSO轴突与aPhN1轴突（可能为VCSO和LSO味觉轴突）紧密聚类（图1D），提示这些疑似咽部味觉神经元具有相似的输出连接。有趣的是，疑似StN轴突与aPhN2轴突（可能为咽部机械感受轴突）混合聚类（图1D），提示它们可能汇聚于相似的下游环路。

基于输出突触连接对StN感觉轴突进行分类
StN轴突表现出不同的分支模式，有些弥散分布，有些则更为局限，提示存在多个亚型（图2）。鉴于这些是感觉轴突，我们比较了它们的输出连接以揭示潜在的功能亚型。

为此，我们根据StN轴突突触后伙伴的相似性，使用余弦相似度对其进行了聚类分析（图2A）。八个缺乏输出突触的StN轴突被排除在此分析之外（图2B）；这很可能反映了FAFB连接组自动突触检测的局限性，而非这些感觉轴突确实缺乏输出突触。使用中间截断阈值，我们的聚类分析揭示了StN轴突的六个亚型（集合1–6）（图2A）。我们注意到，集合的数量随所选阈值的改变而变化，实际上集合2、3和6可能各自包含具有不同输出伙伴和分支模式的额外亚型（图2A、2E、2F和2I）。未来的研究，特别是基于分子和功能特征的研究，可以进一步细化这些类别。有趣的是，每个由功能输出连接性所识别的六个亚型在结构上也各不相同，显示出不同的轴突终止模式，并支配SEZ中的不同亚区域（图2D–2I）。与外部GRNs（其轴突终止部在同一亚型内相互形成突触，例如糖GRNs与其他糖GRNs形成突触）不同，大多数StN亚型几乎没有或完全没有亚型内突触（图2C）。例外是集合6和集合4的StN轴突，它们分别显示出高水平的和中等水平的亚型内突触（集合6平均38.6个突触/轴突，集合4平均3.7个突触/轴突）（图2C）。由于StN的表征尚不充分，未来需要开展研究以确定这些StN亚型是否具有不同的分子身份或生理功能。

图2 基于输出突触连接性对StN感觉轴突的分类

(A) 基于突触后伙伴相似性的StN轴突余弦相似度矩阵。颜色越深表示轴突间相似度越高。在系统树中标注了六个集合。

(B) 单个StN轴突的总输出突触（y轴）与输入突触（x轴）。不同集合以不同颜色标示。八个缺乏预测输出突触的轴突以叉号（×）标示。

(C) 显示所有StN轴突集合间成对突触连接数的矩阵。

(D–I) 不同StN轴突集合的前视图。左图显示所有轴突；右图显示代表性单个轴突。对于集合2、3和6，显示了两个单个轴突以说明存在不同的形态。在所有图像中，浅灰色阴影表示脑部。

StN感觉轴突的下游回路

为研究StN感觉轴突的下游回路，我们利用连接组鉴定了其二级神经元（2N）和三级神经元（3N）。与近期关于GRN连接组的研究类似，我们将StN 2N定义为（更准确地说是根ID）直接位于StN感觉轴突突触后的细胞，排除一阶StN感觉轴突本身。同样，StN 3N定义为位于StN 2N突触后的细胞，排除一阶StN感觉轴突和StN 2N。与领域内许多其他研究一致，使用最少五个突触作为定义突触连接的阈值，以减少假阳性连接。值得注意的是，虽然我们在本文中采用这种广泛使用的五个突触阈值来揭示广泛的下游回路，但提高阈值将使人能够聚焦于可能更具生理相关性的更强连接，尤其是对于较大的3N网络。

不同的StN亚型具有大致不同的2N（图3A–3C），这与基于输出突触连接性的分类结果一致（图2）。例如，集合1的StN轴突有13个2N，其中没有一个位于其他StN轴突亚型的突触后（图3B和3C），表明它们形成独特的输出回路。其他StN轴突亚型也拥有大量各亚型特有的2N（比例为42.9%至83.6%），而其他2N则在两个或多个亚型之间共享（图3B和3C）。这些结果表明，此处识别的StN亚型可能代表具有不同输出回路的独特信息通道，而一小部分2N可能用于整合来自多个通道的信号。

图3 StN二级神经元的分析

(A) 不同StN轴突集合2N的前视图。浅灰色阴影表示脑部。

(B和C) 热图（B）和UpSet图（C），显示不同StN轴突集合间2N的重叠程度。(B)中的颜色相对于每个StN集合到每个2N的突触数量进行标度。

(D) 属于不同超类的2N数量。

(E) 位于SEZ内部与外部的2N输出突触数量。

(F) SEZ内部（左图）与外部（右图）2N输出突触所用的预测神经递质（NT）。ACh，乙酰胆碱；GABA，γ-氨基丁酸；Glu，谷氨酸。

(G) 每组StN 2N在指定非SEZ脑神经结构中驻留的2N输出突触数量。预测的神经递质（NT）以不同颜色标示。

大多数StN 2N是局限于中枢脑部的中枢神经元，但也有其他超类，如上行神经元和下行神经元（图3D）。有趣的是，一些内分泌细胞是集合2–3 StN轴突的突触后细胞，而一些运动神经元（MNs）是集合4–6 StN轴突的突触后细胞（图3D）。这些结果表明存在直接的感觉-内分泌和感觉-运动连接，我们将在后续部分进一步探讨。

大多数StN 2N位于SEZ中，其大部分输出突触也在SEZ中（图3A和3E）。预测StN 2N使用多种神经递质，包括乙酰胆碱（ACh）、γ-氨基丁酸（GABA）和谷氨酸（Glu），尽管这些预测可能并不总是准确的（图3F）。在SEZ之外，上内侧前脑（SMP）是接受所有StN 2N亚型输入的支配神经结构（图3A、3G和S1）。虽然集合3 StN 2N还靶向额外的神经结构，但其他StN 2N亚型除SEZ外几乎专一地靶向SMP（图3A和3G）。这些结果表明SMP在处理来自StN的内部信号方面具有重要意义。

在3N水平上，所有StN亚型都到达由数百到数千个神经元组成的更广泛网络（图4A和4B）。相对较小比例的3N是各亚型特有的（集合3为52.6%，其他为6.0%–33.7%），而许多3N在两个或多个亚型之间共享（图4B和4C）。这些结果表明，StN亚型间的信号整合可能在3N水平上广泛存在。StN 3N由不同超类组成并使用不同的神经递质（图4D和4F）。大多数3N亚型的输出突触位于SEZ内部，除了集合1和3，其约一半输出突触位于SEZ外部（图4E）。特别是集合3的3N靶向广泛的神经结构（图4A和4G）。在SEZ之外，SMP仍然是接受所有StN 3N亚型突触输入的支配脑部区域（图4G），进一步印证了其在StN输出回路中的重要性。

图4 StN三级神经元的分析

(A) 不同StN轴突集合3N的前视图。浅灰色阴影表示脑部。

(B和C) UpSet图（B）和热图（C），显示不同StN轴突集合间3N的重叠程度。(C)中的颜色相对于每组StN 2N到每个StN 3N的突触数量进行标度。

(D) 属于不同超类的3N数量。

(E) 位于SEZ内部与外部的3N输出突触数量。

(F) SEZ内部（左图）与外部（右图）3N输出突触所用的预测神经递质（NT）。ACh，乙酰胆碱；GABA，γ-氨基丁酸；Glu，谷氨酸。

(G) 每组StN 3N在指定非SEZ脑神经结构中驻留的3N输出突触数量。预测的神经递质（NT）以不同颜色标示。

咽部感觉轴突的下游回路

我们接下来研究了来自咽部的感觉轴突的下游回路，包括推测的DCSO轴突以及aPhN1和aPhN2轴突（图1和5A）。大多数这些咽部感觉轴突包含输入和输出突触（图5B），表明它们除传递感觉信号外还可能受到脑部输入的调节。咽部感觉轴突的突触前伙伴包括中枢神经元，以及较小比例的感觉神经元、上行神经元和下行神经元（图S2）。有趣的是，这些突触前神经元中的大多数，特别是非感觉神经元，被预测为GABA能的（图S2），表明它们主要向咽部感觉轴突提供抑制性输入。一条缺乏任何已识别输出突触的aPhN2轴突被排除在后续分析之外（图5B）。DCSO和aPhN1轴突，可能是来自咽部的味觉轴突，形成了中等水平的组内连接（DCSO-DCSO平均5.7个突触/轴突，aPhN1-aPhN1连接平均10.6个突触/轴突）（图5C），与在外部GRNs中观察到的水平相当。

相比之下，aPhN2轴突，可能是来自咽部的机械感觉轴突，彼此之间形成的突触很少（平均0.2个突触/轴突）（图5C）。这些发现暗示了处理味觉与机械感觉信号的不同策略。

图5 咽部感觉轴突二级神经元的分析

(A) 不同咽部感觉神经元组：DCSO、aPhN1和aPhN2的前视图。浅灰色阴影表示脑部。

(B) 单个咽部感觉轴突的总输出突触（y轴）与输入突触（x轴）。不同组以不同颜色标示。一条缺乏预测输出突触的轴突以叉号（×）标示。

(C) 显示所有咽部感觉轴突组间成对突触连接数的矩阵。

(D) 不同咽部感觉轴突组2N的前视图。浅灰色阴影表示脑部。

(E和F) 热图（E）和UpSet图（F），显示不同咽部感觉轴突组间2N的重叠程度。(E)中的颜色相对于每个咽部感觉组到每个2N的突触数量进行标度。

(G) 属于不同超类的2N数量。

(H) 位于SEZ内部与外部的2N输出突触数量。

(I) SEZ内部（左图）与外部（右图）2N输出突触所用的预测神经递质（NT）。ACh，乙酰胆碱；GABA，γ-氨基丁酸；Glu，谷氨酸。

(J) 每个咽部感觉组在指定非SEZ脑神经结构中驻留的2N输出突触数量。预测的神经递质（NT）以不同颜色标示。

为检查aPhN1和aPhN2轴突是否包含不同的亚型，我们基于其突触后伙伴的相似性进行了聚类分析（图S3），类似于对StN轴突进行的分析（图2）。这些分析揭示了aPhN1和aPhN2轴突的若干亚型，但它们的差异不如StN亚型那样显著（比较图2和S3）。因此，我们决定不在后续分析中分别分析aPhN1和aPhN2亚型。

三组咽部感觉轴突具有独特且重叠的2N（图5D–5F）。在已识别的141个DCSO 2N中，仅有24个（17.0%）是DCSO轴突特有的，其余与aPhN1和/或aPhN2轴突共享（图5E和5F）。有趣的是，约一半的DCSO 2N（71/141）同时也是aPhN1 2N（图5E和5F）。这表明DCSO和aPhN1轴突，两者均可能是起源于咽部的味觉轴突，共享许多突触后伙伴。另一方面，更大比例的2N是aPhN1（68.0%）和aPhN2（67.5%）轴突特有的（图5E和5F）。尽管如此，对于任何两组咽部感觉轴突，都存在共同的2N，且有25个2N接受来自全部三组的输入（图5E和5F）。这些结果表明在2N水平上存在咽部信号的显著整合。

DCSO/aPhN 2N主要是中枢神经元，预测使用不同的快速神经递质（图5G和5I）。

值得注意的是，一些运动神经元（MNs）直接位于aPhN2轴突的突触后（图5G），这将在后续章节中作更详细的探讨。DCSO/aPhN二级神经元（2Ns）的大部分输出突触位于咽下区（SEZ），但也存在非SEZ的输出突触，尤其是对于aPhN1 2Ns（图5H和5I）。除SEZ之外，背侧外侧前脑（SLP）和咽下内侧前脑（SMP）是DCSO/aPhN 2Ns的主要靶点（图5D、5J和S1）。侧角（LH）也从DCSO和aPhN1 2Ns接收大量输入（图5J和S1）。这些结果表明，咽部感觉信号——尤其是由DCSO和aPhN1轴突携带的味觉信号——被中继到SEZ之外的多个脑区。

DCSO/aPhN 2Ns与数千个三级神经元（3Ns）形成突触，覆盖中央脑的大比例区域（图6A–6C）。尽管每个群体都有其独特的3Ns，但许多3Ns被两个或多个群体共享，表明存在广泛的信号整合（图6B和6C）。尽管大多数DCSO/aPhN 3Ns是中枢神经元，但有趣的是，相当大一部分是感觉神经元（图6D）。这表明咽部感觉信号可能被用于调节感觉功能。除了SEZ之外，DCSO/aPhN 3Ns还靶向广泛的神经束，并使用多种神经递质（图6E–6G）。SMP、SLP和LH仍然是DCSO/aPhN 3Ns的主要靶点（图6G），进一步表明这些神经束参与处理咽部感觉信号。

图6 咽部感觉轴突的三级神经元分析
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（A）不同群体咽部感觉轴突的3Ns的前视图。浅灰色阴影表示脑。
（B和C）热图（B）和UpSet图（C）展示了不同群体咽部感觉轴突之间3Ns的重叠程度。（B）中的颜色相对于每个群体咽部2Ns到每个咽部3N的突触数量进行缩放。
（D）属于不同超级类别的3Ns数量。
（E）位于SEZ内部与外部的3N输出突触数量。
（F）位于SEZ内部（左图）与外部（右图）的3N输出突触所用的预测神经递质（NT）。ACH，乙酰胆碱；GABA，γ-氨基丁酸；GLUT，谷氨酸。
（G）每个咽部感觉群体的3N输出突触在所示非SEZ脑神经束中的数量。预测的神经递质（NT）以不同颜色表示。

内部感觉轴突与运动或内分泌输出神经元之间的单突触连接

上述一个有趣的发现是，一些运动神经元和内分泌细胞直接位于肠或咽部感觉神经元的突触后（图3D和5G）。感觉神经元向回路提供输入信号，而运动神经元和内分泌细胞分别产生运动和激素输出。感觉神经元与运动神经元或内分泌细胞之间的单突触连接表明存在直接的输入到输出转换，这通常见于简单的反射回路，如膝跳反射。为了进一步探究单突触感觉-运动和感觉-内分泌连接的普遍性，我们计算了每个肠或咽部感觉轴突到达一个运动神经元或内分泌细胞所需的最少突触跳数（例如，值为1表示单突触连接）。作为比较，我们对FlyWire中分类的四组外部味觉受体神经元（GRN）进行了相同的分析：糖/水、苦味、Ir94e（或低盐）和味觉毛。这些分析显示，4至6组StN轴突的大部分，以及近一半的aPhN2轴突，与运动神经元形成单突触连接（图7A和S4）。另一方面，第3组StN轴突的大部分以及少数其他轴突与内分泌细胞形成单突触连接（图7B和S4）。相比之下，没有任何外部GRN与运动神经元或内分泌细胞形成单突触连接（图7A、7B和S4）。这些结果表明，一部分肠和咽部感觉神经元对运动神经元和内分泌细胞的影响可能比外部GRN更为直接。

第4组StN轴突与14个运动神经元形成单突触连接，它们均通过咽神经（PhNs）投射（图7C和7C′）。根据最近的一项研究，这些对应于三个MN10、两个MN11V、两个MN11D、四个MN12D和三个MNx01。除功能尚未表征的MNx01外，其他运动神经元通过控制咽部泵的节奏性活动将液体吸入食管，从而在摄食中发挥重要作用。

第5组StN轴突与四个运动神经元形成突触，这些运动神经元同样通过咽神经投射（图7D和7D′）。它们对应于最近被鉴定的MNx03，其功能仍有待表征。

第6组StN轴突与九个运动神经元形成突触，它们均通过咽神经投射（图7E和7E′）。其中三个是尚未表征的MNx03和MNx05；其他六个是新近发现的支配嗉囊的肠运动（CEM）神经元，它们控制食物进入嗉囊——一种昆虫的储食器官。这些结果表明，第6组StN轴突可能在摄食过程中调节食物储存方面发挥作用。

图7 一部分StN和咽部感觉轴突直接突触于运动或内分泌神经元
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（A和B）所示感官轴突群体到运动神经元（A）或内分泌细胞（B）的最少突触跳数的小提琴图。值为1表示单突触连接。StN1–6为不同的StN轴突组；DCSO、aPhN1和aPhN2为咽部感觉轴突；糖/水、苦味、Ir94e和味觉毛为不同的口器味觉受体神经元（GRN）群体。详见正文。不同字母表示差异显著的群体（alpha = 0.05），经Kruskal-Wallis检验后由Dunn多重比较检验得出。
（C–G′）形成单突触连接的所示感觉轴突群体（突触前）与运动或内分泌神经元（突触后）的前视图。在所有图中，浅灰色阴影表示脑。

约一半的aPhN2轴突与11个运动神经元形成单突触连接（图7F和7F′）。其中两个通过上颚-唇神经（MxLbNs）投射，被鉴定为MN8，其控制唇瓣展开以摄入食物。其余九个运动神经元通过咽神经投射，包括一个MN9、一个MN10、两个MN11V、两个MN12D和三个MNx01。MN9控制喙的抬起以接近食物，通常是对食欲性食物信号作出反应。喙的抬起和唇瓣的展开是摄食启动阶段执行的运动程序的一部分，用于评估食物来源，它们在食物摄入阶段也必须持续进行。上述发现表明，一部分aPhN2轴突的咽部信号可能有助于维持这些运动程序，从而实现对食物的持续摄入。值得注意的是，aPhN2和第4组StN轴突共享几个突触后运动神经元（图7C、7C′、7F和7F′）——包括控制咽部泵送和摄食的MN10、MN11V和MN12D——表明这两种感觉群体在运动神经元层面存在信号整合。

最后，第3组StN轴突与五个内分泌细胞形成突触（图7G和7G′），它们均被鉴定为表达果蝇肌抑制肽（DMS）的中位神经分泌细胞。成年果蝇脑中总共含有六个DMS中位神经分泌细胞，它们通过直接和间接通路接收感觉输入。这些细胞支配嗉囊，DMS调节嗉囊运动，并在交配后增加雌蝇摄食量方面发挥作用。因此，第3组StN轴突靶向大多数DMS中位神经分泌细胞，可能在调节嗉囊生理和摄食方面发挥作用。

讨论

在本研究中，我们利用最近完成的果蝇脑连接组（FAFB connectome），系统性地鉴定了来源于肠StN和不同咽部感觉器官的内部感觉轴突。这些感觉轴突在将胃肠道和咽部的内部感觉信息中继到大脑以调节摄食方面发挥重要作用，但其解剖结构和功能仍未被完全理解。我们发现，StN感觉轴突包含具有不同轴突分支模式和输出回路的亚型，提示具有不同的生理功能（图2、3和4）。咽部感觉轴突支配SEZ更靠后的区域，推测的味觉和机械感觉轴突靶向不同的亚区域（图1）。通过分析下游回路，我们发现SMP是StN和咽部感觉轴突的主要输出靶点，而后一组还靶向额外的神经束（图3、4、5和6）。有趣的是，我们鉴定出从一部分StN和咽部感觉轴突到运动神经元和内分泌细胞的单突触连接，表明来自肠和咽部的内部信号可能被用于直接控制运动和内分泌输出（图7和S4）。总之，本工作为未来研究多样的内部感觉信号如何调节摄食行为及相关内分泌功能奠定了坚实基础。

需要未来研究来确定这里鉴定的StN亚型是否具有不同的分子身份和/或携带不同的感觉信号。StN起源于HCG-CC区域，并向脑传入信号。CC含有约13–23个表达脂动激素（AKH）的细胞，该激素动员能量储备以维持循环糖水平，类似于哺乳动物的胰高血糖素。HCG的表征程度较低，不同研究估计由约15–50个细胞组成。其中，约5–6个细胞表达机械感受受体Piezo，功能是在胃肠道膨胀时抑制摄食。另有4–8个HCG细胞表达味觉受体Gr43a，功能是检测肠腔中的糖水平并引导食物进入嗉囊。已显示出若干神经肽/神经递质及其受体也在HCG中表达，包括sNPF和sNPF-R、DMS和DMS-R1、5-羟色胺受体、CCHa1-R和AstC-R1，介导从调节嗉囊运动到感知钠盐等多种功能。这些发现表明，HCG包含在分子和功能上各不相同的多样亚型。然而，这些HCG亚型在中枢脑中的轴突投射在很大程度上尚未表征。这可能源于技术挑战，因为上述所有分子也在HCG以外的细胞中表达，使得难以特异性标记HCG神经元。未来研究可采用交叉遗传策略为HCG亚型生成更特异性的遗传驱动工具。这可能有助于更好地表征其轴突模式，并帮助确定这里鉴定的StN亚型是否对应HCG神经元的不同分子亚型。另一种策略是从其连接推断StN亚型的功能或身份。例如，第6组StN轴突与四个IN1神经元形成突触，而IN1神经元已知接收来自表达味觉受体Gr43a的HCG神经元的输入。这表明第6组StN轴突可能就是表达Gr43a的HCG神经元。有趣的是，第6组StN轴突直接与CEM神经元形成突触（图7），而CEM神经元也接收来自IN1的输入，表明第6组StN轴突可以直接或通过IN1间接与CEM神经元交流。最后，第6组StN轴突彼此形成许多突触（图2C），这是外部GRN也共有的特征，进一步支持了我们认为它们是味觉的推测。

对下游回路的分析揭示了几个接收推测的肠和咽部感觉轴突输入的脑区。SMP是StN和咽部感觉轴突的主要输出靶点（图3、4、5和6），凸显了其在处理和整合内部感觉信号方面的重要性。已知SMP接收外部味觉信息，以及内部信号——如饥饿、口渴和生殖状态——以调节糖和水的摄入。此外，SMP在解剖上相邻且在功能上与咽间脑（PI）相联系，PI是一个主要的内分泌结构，分泌多种参与调节摄食、代谢和能量稳态的肽类激素。一部分5-羟色胺能神经元，即糖-SEL投射神经元，在解剖上将SEZ与SMP连接起来。这些神经元直接位于多种StN轴突亚型（第4至6组）以及aPhN1和aPhN2咽部感觉轴突的突触后（图3和5），表明它们可能是将多样的肠和咽部信号中继到SMP的重要通路。

咽部感觉轴突，尤其是味觉相关的轴突，靶向额外的神经中枢，包括SLP和LH（图5和图6）。SLP是味觉投射神经元的重要靶点。我们的结果支持这一结论，并进一步表明SLP很好地具备了整合口腔和咽部味觉信息的能力。LH最为人所知的是其在中介对嗅觉信号的先天性行为中的作用。我们的发现表明，LH也接收来自咽部的味觉输入，这暗示了它在气味-味觉整合中的潜在作用。我们研究中一个有趣的发现是，一部分StN和咽部感觉轴突向运动神经元（MNs）和内分泌细胞提供单突触输入（图7和图S4）。感觉神经元与运动神经元之间的单突触连接通常出现在简单的反射回路中，如膝跳反射。它们被认为是快速和简单信号处理的基础，并中介定型反应。我们的发现表明，几组StN和咽部感觉轴突与各种运动神经元和内分泌细胞形成单突触连接（图7和图S4），这提示来自肠道和咽部的内部信号可能直接影响与进食相关的运动程序和内分泌功能。相比之下，来自外部GRN到运动神经元或内分泌细胞的连接总是多突触的（图7和图S4）。这表明外部味觉信号对运动和内分泌功能的影响可能不那么直接，并会受到整合或调节的影响，如内部状态或经验。类似的回路结构也在幼虫果蝇的进食连接组中观察到。未来的研究应更好地使用生理和行为方法表征这些单突触感觉-运动和感觉-内分泌连接，并确定它们是否中介定型、反射样的反应。

**研究的局限性**

虽然全脑连接组对神经回路研究非常宝贵，但它代表的是来自单个个体的大脑的静态快照，因此可能存在个体和发育变异。此外，虽然自动突触检测和神经递质预测已经达到了高水平的准确性，但它们并不总是正确的。随着更多连接组的可用性，包括成年雄性和雌性果蝇整个中枢神经系统的连接组，未来的研究可以比较这些数据以识别潜在的个体或性别差异。最后，功能研究对于测试从连接组得出的关于神经元连接及其生理作用预测是必不可少的。

**资源可用性**

**主要联系人**

进一步的信息和资源请求应联系主要联系人，Zepeng Yao（[e-mail]），并将由主要联系人满足。

**材料可用性**

本研究没有产生新的独特试剂。

**数据和代码可用性**

- 本论文报告的数据将在请求时由主要联系人共享。
- 所有原始代码已存储在GitHub上，并在发表之日公开可用。URL链接列在关键资源表中。
- 重新分析本论文报告数据所需的任何附加信息可从主要联系人处请求获得。

**致谢**

我们感谢Meet Zandawala在余弦相似度聚类分析方面提供的帮助，以及Philipp Schlegel在咽神经感觉轴突方面的讨论。我们感谢Anita Devineni和Gregory Jefferis的实验室以及更广泛的果蝇神经科学社区分享连接组代码和注释。我们感谢普林斯顿FlyWire团队以及Mala Murthy和Sebastian Seung实验室的成员开发和维护FlyWire。Yao实验室的成员提供了有益的输入。本工作得到了佛罗里达大学启动资金和美国国立卫生研究院（NIH）拨款号R01DK139131的支持。

**作者贡献**

Z.Y.构思并监督了该项目。D.S.G.进行了大部分分析，Z.Y.、J.M.Z.和A.J.提供了输入，J.M.Z.和A.J.协助了神经元的3D渲染和图形准备。Z.Y.和D.S.G.生成了图形，Z.Y.撰写了手稿，所有作者都提供了输入。

**利益声明**

作者声明没有竞争利益。

**STAR★方法**

**关键资源表**

**试剂或资源 | 来源 | 标识符**

存储数据：FlyWire FAFB连接组（v783快照） | FlyWire Codex | https://codex.flywire.ai/?dataset=fafb
FlyWire Codex数据导出（FAFB） | FlyWire Codex | https://codex.flywire.ai/api/download?dataset=fafb

软件和算法：Python 3.12 | Python Software Foundation | http://www.python.org
R (v4.4.2) | R Project | https://www.r-project.org
JetBrains Dataspell（Jupyter） | JetBrains | https://www.jetbrains.com/dataspell/
Coconatfly (v0.2.4) | Jefferis Lab | https://github.com/natverse/coconatfly
味觉连接组代码 | Devineni Lab | https://github.com/avdevineni/taste-connectome.git
Neuroglancer（3D神经元查看器） | Google | https://github.com/google/neuroglancer
本文分析代码 | 本文 | https://github.com/ZepengYao-Lab/Giakoumas-et-al
GraphPad Prism 10 | GraphPad | https://www.graphpad.com

**实验模型和受试者细节**

由于我们的研究不涉及实验模型或受试者，故省略。

**方法细节**

**识别推测的肠道和咽部感觉轴突**

我们使用FlyWire Codex（https://codex.flywire.ai/?dataset=fafb）中的FAFB数据集（版本783）来识别咽神经（PhN）和副咽神经（aPhN）中的感觉神经元。具体来说，我们使用搜索查询"nerve = = PhN && super_class = = sensory"和"nerve = = aPhN && super_class = = sensory"来分别识别PhN和aPhN感觉轴突。细胞/根ID和相关元数据，包括突触和注释，从FlyWire Codex中检索。我们使用FlyWire的3D查看器（https://codex.flywire.ai/app/view_3d?dataset=fafb）在果蝇大脑网格中将识别的感觉神经元进行3D渲染。我们基于轴突数量、分支模式、神经进入以及FlyWire中的注释的组合，确定了它们的身体部分来源（StN、DCSO等）和感觉模态（味觉或机械感觉）。细节在结果部分描述。

**基于输出连接对感觉轴突进行聚类**

我们基于其突触后伙伴的相似性对感觉轴突进行聚类。使用余弦相似度方法来测量相似性，并使用Ward最小方差层次聚类方法的Ward D2实现来进行层次聚类。在分析时，FlyWire FAFB v783的默认突触预测由Buhmann等人生成；这些所谓的Buhmann突触在整个分析中使用。根据FlyWire建议的过滤约定以去除假阳性连接，仅包含至少五个突触的神经元连接。使用R (v4.4.2)中的Coconatfly (v0.2.4)包在DataSpell Jupyter Notebook中生成热图和树状图。

**分析第二和第三级下游神经元**

我们改编了Walker等人使用的方法和代码，对肠道和咽部感觉轴突下游的第二级神经元（2Ns）和第三级神经元（3Ns）进行分析，并做了小幅修改。类似于Walker等人，我们将2Ns定义为与感兴趣的感觉轴突直接突触后连接的细胞（或根ID，更准确地说），不包括一级感觉轴突。同样，3Ns是与2Ns突触后连接的细胞（或根ID），不包括2Ns和一级感觉轴突。我们使用五个突触的阈值来识别2Ns和3Ns的神经元连接。2Ns或3Ns的列表用于产生热图，显示指示感觉组中2Ns或3Ns的重叠程度。使用对数缩放的着色方案来表示输入突触的数量。这些列表还用于生成UpSet图，以揭示2Ns或3Ns按神经元计数的交集。如前所述，分析2N和3N的超类、突触位置和突触神经递质预测。咽部感觉轴突突触前伙伴的分析以类似的方式进行。根据Walker等人，我们将SEZ定义为由以下神经中枢组成：颚神经节（GNG）、前锋（PRW）、鞍（SAD）、法兰（FLA）和坎特尔（CAN）。所有其他神经中枢被归类为非SEZ。神经中枢缩写基于Ito等人。

**分析到运动或内分泌神经元的最少突触跳跃数**

对于不同感觉组中的每个根ID，我们计算了到达运动神经元或内分泌细胞所需的最少突触跳跃数。仅包含≥5个突触的连接。因此，值为1表示单突触连接。除了内部感觉轴突外，我们还分析了外部GRN以进行比较。在FlyWire Codex（https://codex.flywire.ai/?dataset=fafb）中用于检索不同组外部GRN根ID的具体搜索查询如下：

- 糖/水：nerve = = MxLbN && class = = gustatory && sub_class = = sugar/water
- 苦味：nerve = = MxLbN && class = = gustatory && sub_class = = bitter
- Ir94e（或低盐）：nerve = = MxLbN && class = = gustatory && sub_class = = low-salt
- 味觉刺：nerve = = MxLbN && class = = gustatory && sub_class = = taste_peg

为了可视化每个感觉组的下游回路，我们使用线性流桑基图来说明下游神经元，基于它们的超类，从感觉神经元起最多三个突触跳跃。仅包含≥5个突触的连接，反馈连接未被过滤掉。每个节点和流代表突触输出连接的总量，流的厚度相对于其源节点的总流出量进行缩放。

**量化和统计分析**

为了确定不同感觉组在到运动神经元或内分泌神经元的最少突触跳跃数上是否存在差异（图7），我们使用GraphPad Prism 10进行了Kruskal-Wallis检验，随后进行了Dunn多重比较检验。p值<0.05被认为具有统计学意义。

**补充信息**

(1) PDF（2.11 MB）文件S1. 图S1–S4