《iScience》：Exercise-associated epigenetic remodeling and TCR repertoire dynamics in Lynch syndrome carriers
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林奇综合征（Lynch syndrome，LS）携带者具有较高的癌症风险。新出现的证据表明，运动可能作为一种非药物性预防策略，然而其在该人群中发挥保护作用的表观遗传和免疫学机制仍不清楚。在此，研究人员对接受52周有氧骑行干预的LS携带者进行了DNA甲基化、基因
林奇综合征（Lynch syndrome，LS）携带者具有较高的癌症风险。新出现的证据表明，运动可能作为一种非药物性预防策略，然而其在该人群中发挥保护作用的表观遗传和免疫学机制仍不清楚。在此，研究人员对接受52周有氧骑行干预的LS携带者进行了DNA甲基化、基因表达和T细胞受体（T cell receptor，TCR）库的综合多组学分析。研究人员鉴定了区室特异性的DNA甲基化变化，包括循环游离DNA（cfDNA）中的先天免疫激活和组织中的致癌通路抑制。整合转录组学分析突显了ISL1作为运动抑制的关键表观遗传调控基因，并确定了FLCN作为结直肠癌（colorectal cancer，CRC）相关的甲基化靶点。TCR分析揭示了运动相关的系统性库多样性增加和组织特异性克隆趋同，从而提示抗原驱动的募集。总的来说，这些发现揭示了表观遗传和免疫重塑是运动介导的LS保护作用的潜在机制。
**研究背景与意义**
林奇综合征（Lynch syndrome，LS）是最常见的遗传性癌症综合征之一，以常染色体显性方式遗传，由于DNA错配修复（mismatch repair，MMR）基因的胚系突变，携带者罹患结直肠癌（colorectal cancer，CRC）、子宫内膜癌及其他肿瘤的风险显著升高。携带缺陷MMR系统的个体发生CRC的风险较普通人群高出40%–80%。因此，寻找有效的微创干预策略以降低LS携带者的CRC风险，是临床与转化研究的重点方向。有氧运动在普通人群中被广泛认为是多种疾病的预防和干预手段，越来越多的证据也表明其与高危人群CRC风险降低相关。一项大型队列研究显示，LS个体中较高的体力活动水平与较低的CRC风险相关。此前的研究已证实，LS携带者接受52周有氧骑行运动后，结肠黏膜抗肿瘤免疫增强且炎症减轻，提示运动可能作为该高危人群有效的非药物性预防策略。为进一步阐明这些效应背后的分子机制，本研究利用同一LS携带者队列，全面分析了运动诱导的表观遗传景观变化和T细胞受体（T cell receptor，TCR）库动态。
DNA甲基化是调控基因表达的关键表观遗传机制，与癌症相关，并受遗传、环境和生活方式因素（包括体力活动）的影响。在癌症中，甲基化模式可作为细胞起源和疾病状态的稳定生物标志物。然而，甲基化变化的功能影响高度依赖于环境，因为CpG甲基化变化只有在适当的细胞和组织环境中才能产生有意义的调控效应。在高危人群（如LS携带者）中，早期甲基化变化可能先于组织学异常出现，这使得结肠组织和循环游离DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA）中的DNA甲基化谱对于阐明运动发挥健康益处的表观遗传机制至关重要。免疫监视是运动可能调节的另一个关键机制。在LS中，MMR胚系突变在获得第二次体细胞打击后导致微卫星不稳定（microsatellite instability，MSI），产生新抗原并触发强烈的T细胞介导免疫反应。LS携带者被认为一生处于持续的“癌前状态”，其免疫微环境可能已表现出肿瘤发生前的失调特征。有氧运动已知可调节T细胞功能并增强健康个体和癌症患者的TCR库多样性。据此推测，长期有氧运动可能重塑LS携带者的TCR库，并可能有助于增强免疫监视和延缓肿瘤发生。通过整合结肠黏膜和外周血的DNA甲基化组、转录组和TCR库数据，本研究探讨了52周有氧运动干预对LS携带者的分子和免疫学效应，并旨在鉴定运动诱导的甲基化调控基因以及TCR库多样性和克隆组成的变化。
**研究方法与关键技术**
本研究基于CYCLE-P临床试验（ClinicalTrials.gov：NCT03495674）的队列，纳入16名LS携带者（运动组9人，对照组7人），其中8人（每组4人）纳入免疫队列。运动组接受为期52周、每周3次、每次45分钟的有氧骑行训练；对照组接受常规护理咨询。在基线和52周后采集外周血和结肠活检组织。主要技术方法包括：采用甲基化DNA免疫沉淀测序（MeDIP-seq）对结肠组织DNA和cfDNA进行全基因组甲基化谱分析；采用简化代表性亚硫酸氢盐测序（RRBS）对3例LS相关CRC患者的肿瘤及配对的正常结肠组织进行单碱基分辨率甲基化分析；利用mRNA-seq数据进行转录组分析；采用ImmunoSEQ平台进行TCRβ链高通量测序。数据分析采用LASSO回归、随机森林（RF）和支持向量机（SVM）三种机器学习模型筛选差异甲基化区域（DMRs），并通过线性回归模型整合甲基化与表达数据以鉴定运动响应的表观遗传调控基因。
**研究结果**
**运动诱导的全局DNA甲基化模式变化和eDMRs鉴定**
在cfDNA中，运动组呈现非显著的低甲基化趋势，而对照组甲基化显著增加（p = 0.047）。相反，组织来源DNA在运动组中甲基化显著增加（p = 0.019），对照组呈非显著低甲基化趋势。根据预设的统计学和方向性标准，研究鉴定了cfDNA相关eDMRs 9,727个和组织相关eDMRs 4,241个。cfDNA相关的低甲基化eDMRs主要富集于启动子区域（42.54%），而cfDNA相关高甲基化和组织相关eDMRs主要位于远端基因间区。主成分分析显示运动组和对照组在组织和cfDNA样本中均明显分离。通过三种机器学习模型筛选，最终确定350个高置信度组织来源DMRs，映射到269个独特基因，ROC分析显示三个模型的AUC值均>0.90。
**运动诱导的组织表观遗传调控基因鉴定**
通过构建基因特异性线性回归模型（以运动组为交互项，校正年龄和性别），在269个候选基因中发现4个基因（HMGCS1、ISL1、ITGAV和MFHAS1）的启动子甲基化与基因表达呈显著负相关（p < 0.05）。整合转录组数据后，只有ISL1在运动组中表现出显著的表达下调（BH校正p < 0.05）。此外，对178个CRC相关基因的定向分析发现FLCN、MDM2和RAF1三个基因表现出运动相关的甲基化-表达负相关关系。其中，FLCN在运动组中启动子甲基化显著增加（p = 0.018）。
**功能富集分析和RRBS数据通路水平验证**
对cfDNA来源低甲基化eDMGs的富集分析显示主要涉及免疫反应和感染相关通路，包括Fc gamma R介导的吞噬作用、白细胞跨内皮迁移、内吞作用和溶酶体等。组织来源高甲基化eDMGs显著富集于细胞信号和粘附通路，包括PI3K-Akt和钙信号通路。肿瘤来源低甲基化基因主要富集于发育调控、激素信号和细胞组织相关通路。组织高甲基化eDMGs与肿瘤低甲基化DMGs的比较发现了5个共享通路（轴突导向、轴突发生、粘附连接、致心律失常性右心室心肌病和肥厚型心肌病），这些通路在运动与肿瘤样本中呈现相反的甲基化模式。
**运动促进系统性TCR库多样性同时降低局部组织多样性**
在外周血中，运动组随时间推移表现出更高的库多样性（Inverse Simpson指数增加、Gini系数降低，p < 0.05），表明克隆优势降低和均匀度提高。在组织样本中，运动组呈现相反模式：rarefaction曲线降低、Inverse Simpson指数减少、Gini系数增加。效应量分析显示，运动组外周血Gini系数变化呈中到大效应量（d = ?0.81），而对照组组织样本在多样性和克隆性指标上均表现出大效应量（Inverse Simpson指数：d = 1.19；Gini系数：d = ?1.31）。
**运动增强外周TCR库稳定性并促进组织浸润T细胞迁移**
Morisita重叠指数（MOI）分析显示，运动组所有参与者的外周血TCR库在基线和随访间均表现出高相似性，而对照组变异较大。在组织样本中，两组均表现出可变的库相似性。对血液中前100个最扩增克隆的分析显示，运动组中3/4的参与者表现出共享克隆增加和组织累积丰度升高（p < 0.05），而对照组无一致变化。V和J基因使用频率及V-J配对频率在两组中均保持稳定。
**运动在氨基酸和核苷酸水平重塑TCR克隆结构**
CDR3序列相似性网络分析显示，外周血中运动组所有4名参与者在干预后网络密度增加，而对照组呈下降趋势。组织样本中运动组网络密度降低，对照组略有增加。TCR简并性分析显示克隆型频率与简并性水平呈负相关，高扩增克隆通常具有低简并性。低简并性克隆（≤1）主要为私有克隆，而高简并性克隆（≥5）多为公共克隆。运动后外周血高简并性克隆比例显著降低（p < 0.05），而结肠组织中增加。
**结论与展望**
本研究首次在LS携带者中整合DNA甲基化组、转录组和免疫组学数据，揭示了有氧运动对该高危人群表观遗传和适应性免疫的多层面调控作用。研究表明，运动诱导的组织高甲基化可能部分抵消肿瘤相关的表观遗传改变，增强基因组稳定性；cfDNA低甲基化反映先天免疫激活，与运动降低循环前列腺素E2（PGE2）的发现相一致。组织来源高甲基化基因富集于PI3K-Akt和钙信号等致癌通路，提示运动可能通过表观遗传抑制促肿瘤信号。ISL1作为运动反应的关键表观遗传调控基因，其下调可能代表运动介导的肿瘤抑制机制。TCR库分析揭示了运动诱导的系统性库多样化与组织特异性克隆聚焦的双重效应，提示抗原特异性T细胞克隆向组织的募集和扩增可能增强对癌前病变的免疫监视。该研究为运动在LS携带者中的癌症预防作用提供了潜在的机制基础，并为未来整合多组学分析与临床终点、扩展至其他癌症易感综合征和散发型CRC人群的研究奠定了基础。
