《Cancer Management and Research》：Synergistic Combination of Hypericin-Mediated Photodynamic Therapy and HIF-1α siRNA Inhibits Triple-Negative Breast Cancer via Inducing PANoptosis in vitro
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摘要
背景：三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）是一种侵袭性乳腺癌亚型，与全球高发病率和死亡率相关。金丝桃素（Hypericin, HYP）是一种天然光敏剂，可优先蓄积于肿瘤组织。光动力疗法（photodyn
摘要
背景：三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）是一种侵袭性乳腺癌亚型，与全球高发病率和死亡率相关。金丝桃素（Hypericin, HYP）是一种天然光敏剂，可优先蓄积于肿瘤组织。光动力疗法（photodynamic therapy, PDT）是一种新兴的抗癌策略，通过分子氧存在下光活化光敏剂产生活性氧（reactive oxygen species, ROS）来消除肿瘤细胞。然而，PDT引起的氧消耗可能进一步加剧肿瘤缺氧。在本研究中，研究人员评估了金丝桃素介导的光动力疗法联合siHIF-1α（HYP-siHIF）在TNBC细胞中的协同抗肿瘤效应。
方法：采用MTT实验评估HYP-PDT单独或联合siHIF对TNBC细胞活力的影响。使用荧光探针DCFH-DA评估细胞内ROS水平。进行RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）分析以探索HYP-siHIF处理诱导的潜在分子变化。采用透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）和Hoechst染色评估细胞形态学改变，同时采用流式细胞术评估细胞凋亡。使用蛋白质印迹法检测与细胞死亡通路相关的蛋白表达水平。
结果：HYP-siHIF显著抑制TNBC细胞活力，增加细胞内ROS蓄积，并诱导与细胞凋亡、细胞焦亡和坏死性凋亡相关的形态学及分子特征。在机制上，本研究提供了HYP-siHIF在PDT处理后激活PANoptosis相关细胞死亡通路的证据。在细胞凋亡方面，HYP-siHIF增加Bax表达，降低Bcl-2表达，并增强caspase-9/3/7的切割。在细胞焦亡方面，HYP-siHIF增加NLRP3表达并促进GSDMD和GSDME的切割。在坏死性凋亡方面，HYP-siHIF显著增加RIP3和MLKL的磷酸化水平。
结论：HYP-PDT与siHIF表现出协同抗肿瘤效应，其与PANoptosis相关细胞死亡通路的激活相关。HYP-siHIF可能代表一种TNBC的潜在治疗方法，值得进一步的机制和转化研究。
金丝桃素介导的光动力疗法联合HIF-1α siRNA通过诱导PANoptosis抑制三阴性乳腺癌的体外研究解读
一、研究背景
三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）是乳腺癌中最具侵袭性的亚型，以缺乏雌激素受体（estrogen receptor, ER）、孕激素受体（progesterone receptor, PR）和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2, HER2）表达为主要特征。TNBC约占所有乳腺癌的15%–20%，与其他乳腺癌亚型相比，具有更侵袭性的生物学特征、更高的复发率和更差的临床预后。由于缺乏可干预的分子靶点，TNBC患者从内分泌治疗和HER2靶向治疗中获益有限，化疗成为主要的全身治疗选择。然而，治疗耐药、疾病复发和转移仍然是重大的临床挑战，迫切需要识别新的分子靶点并开发更有效的TNBC治疗策略。
程序性细胞死亡（programmed cell death, PCD）在疾病进展、免疫调节和宿主防御中发挥重要作用。细胞凋亡是最早被识别的调节性细胞死亡形式，此外，坏死性凋亡和细胞焦亡也被认为是PCD的不同形式。越来越多的证据表明，不同PCD通路之间存在广泛的串扰。2019年，"PANoptosis"（细胞焦亡、细胞凋亡和坏死性凋亡）的概念被提出，作为一种整合形式的炎症性程序性细胞死亡。PANoptosis由PANoptosome（一种多蛋白复合物）调控，协调细胞焦亡、细胞凋亡和坏死性凋亡信号通路的激活。作为PCD的新兴形式，PANoptosis已被证实在癌细胞死亡调控和肿瘤抑制中发挥作用，并可能与乳腺癌的发展和预后相关。因此，靶向PANoptosis相关细胞死亡通路可能代表一种潜在的乳腺癌治疗策略。
金丝桃素（Hypericin, HYP）是从贯叶金丝桃（Hypericum perforatum）中提取的主要生物活性成分之一，在可见光光谱中具有590 nm和545 nm两个主要吸收峰，具有强光毒性、低暗毒性和光激活后高效产生活性氧（reactive oxygen species, ROS）的特性。此外，HYP对肿瘤细胞具有高亲和力，可优先蓄积于肿瘤组织。光动力疗法（photodynamic therapy, PDT）是一种新兴的非侵入性治疗方法，通过特定波长的光照射被细胞吸收的光敏剂，光活化光敏剂与分子氧反应生成ROS，选择性杀伤和破坏肿瘤细胞或诱导细胞凋亡。金丝桃素介导的光动力疗法（HYP-PDT）已在多种肿瘤模型中显示出抗癌活性。然而，HYP-PDT在三阴性乳腺癌中的分子机制仍未完全阐明，且PDT在癌症治疗中的更广泛应用仍受到若干限制。
PDT过程中光活化光敏剂与氧分子之间发生一系列光化学反应，产生的ROS可直接损伤肿瘤细胞。然而，PDT也可能损伤肿瘤微血管并诱导血管收缩，导致肿瘤组织内血流灌注减少和缺氧状况加重。PDT诱导的缺氧被认为是不利后果，可能导致治疗耐药和疗效降低。缺氧可激活多种适应性信号通路，其中缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α）是核心调控因子。已有研究表明，PDT可增加HIF-1α表达，进而激活氧调控靶基因，促进癌细胞在应激条件下的存活和适应。因此，将PDT与HIF-1α沉默相结合，是一种克服PDT相关缺氧反应的潜在策略，其中PDT诱导ROS介导的肿瘤细胞损伤，而siHIF抑制HIF-1α介导的存活信号和肿瘤进展。
二、主要技术方法
本研究采用了以下关键技术方法：使用MTT实验评估细胞活力并计算半数抑制浓度（IC50）值，通过Jin公式计算Q值评估联合用药的协同效应；采用qPCR验证siRNA敲低效率和HIF-1α mRNA表达水平；利用RNA测序（RNA-seq）分析差异表达基因并进行GO和KEGG通路富集分析；使用DCFH-DA荧光探针结合荧光显微镜和流式细胞术检测细胞内ROS水平；采用透射电子显微镜（TEM）观察细胞超微结构变化；通过Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术和Hoechst 33342染色评估细胞凋亡；采用蛋白质印迹法检测细胞凋亡、细胞焦亡和坏死性凋亡相关蛋白表达。细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468均来源于ATCC。
三、研究结果
1. HYP-PDT抑制MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞增殖并上调HIF-1α表达
MTT实验结果显示，HYP-PDT以剂量依赖性方式显著降低MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的活力，IC50值分别为33.5 nM和14.9 nM。qPCR分析表明，HYP-PDT处理后HIF-1α mRNA表达水平显著升高。通过设计三条靶向HIF-1α的siRNA序列，其中siRNA2210在两种TNBC细胞中均表现出最高的敲低效率，因此被选为siHIF用于后续实验。
2. siHIF增强MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞对HYP-PDT的敏感性
联合治疗实验显示，siHIF单独处理使MDA-MB-231细胞活力降低28.12±1.03%，而siHIF与HYP-PDT联合产生更显著的抑制效果。在MDA-MB-231细胞中，siHIF联合不同浓度HYP（30、40和50 nM）的Q值分别为1.17、1.21和1.18，表明协同抑制效应。在MDA-MB-468细胞中，siHIF联合HYP浓度（15、20和25 nM）的Q值分别为1.25、1.23和1.16，同样显示协同效应。基于这些结果，后续实验选择30 nM HYP联合siHIF处理MDA-MB-231细胞，15 nM HYP联合siHIF处理MDA-MB-468细胞。
3. HYP-siHIF增强细胞内ROS蓄积
DCFH-DA荧光探针检测结果显示，与对照组相比，HYP-PDT单独处理或HYP-siHIF处理均显著增加DCF荧光强度，表明细胞内ROS蓄积增强。流式细胞术定量分析进一步证实了这一发现。siHIF单独处理未诱导明显的ROS水平升高。
4. RNA-seq及数据分析
对MDA-MB-231细胞进行RNA-seq分析，以FDR<0.05和|log2 fold change|>1为标准，在HYP-siHIF组中鉴定出288个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），其中202个基因上调，86个基因下调。GO富集分析显示这些DEGs涉及凋亡过程、程序性细胞死亡调控、炎症反应、免疫系统过程、细胞对应激的反应等。KEGG通路富集分析显示涉及FoxO信号通路、MAPK信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用等，提示HYP-siHIF处理诱导了与凋亡、炎症和坏死性凋亡相关的广泛转录改变。
5. HYP-siHIF在MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中激活PANoptosis相关细胞死亡特征
TEM观察发现，对照组细胞形态规则，质膜和核膜完整，染色质分布均匀。HYP-siHIF处理后，细胞表现出多种PCD相关的超微结构特征：凋亡特征包括染色质浓缩、核边集和细胞颗粒度增加；焦亡相关形态学特征包括大膜泡形成、细胞肿胀和质膜破裂；坏死性凋亡相关特征包括细胞质电子密度降低、核周间隙扩张和核压缩。这些发现表明HYP-siHIF处理诱导了与细胞凋亡、细胞焦亡和坏死性凋亡相关的多种超微结构改变。
6. HYP-siHIF促进MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞凋亡
Annexin V-FITC/PI染色结果显示，HYP-siHIF处理后，两种细胞中早期凋亡和晚期凋亡细胞的比例均显著增加。Hoechst 33342染色观察到异常细胞核发生率升高，表现为典型的凋亡特征，包括染色质不规则浓缩、核皱缩和凋亡小体形成。
7. HYP-siHIF调节MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中凋亡、焦亡和坏死性凋亡相关蛋白表达
蛋白质印迹分析显示，在凋亡相关蛋白方面，HYP-siHIF处理降低Bcl-2表达并增加Bax表达，同时降低总caspase-9、caspase-7和caspase-3水平，增加cleaved caspase-9、cleaved caspase-7和cleaved caspase-3水平。在焦亡相关蛋白方面，HYP-siHIF处理增加NLRP3表达，显著降低总GSDMD和GSDME水平。值得注意的是，cleaved GSDMD和cleaved GSDME主要在MDA-MB-231细胞中检测到，而MDA-MB-468细胞虽表现出NLRP3表达增加和总gasdermin水平改变，但未观察到可检测的cleaved gasdermin蓄积。在坏死性凋亡相关蛋白方面，HYP-siHIF处理降低总RIP3和MLKL表达，同时增加磷酸化RIP3和磷酸化MLKL水平。
四、讨论与结论
本研究首次在TNBC细胞中探索了HYP-PDT与HIF-1α沉默联合的抗肿瘤效应。研究发现，HYP-siHIF通过增加细胞内ROS蓄积，激活了PANoptosis相关的多条细胞死亡信号通路，包括凋亡（Bax/Bcl-2/caspase-9/3/7通路）、焦亡（NLRP3/GSDMD/GSDME通路）和坏死性凋亡（RIP3/MLKL通路）。RNA-seq分析揭示HYP-siHIF诱导的转录改变涉及多个细胞死亡相关过程，而非单一死亡通路，进一步支持PANoptosis的参与。
研究存在的局限性包括：所有实验均在常氧培养条件下进行，而肿瘤缺氧可能显著影响HIF-1α信号和PDT反应；siRNA介导的HIF-1α抑制仅在mRNA水平得到验证，在常氧条件下由于HIF-1α的氧依赖性快速降解，蛋白质水平的直接验证仍具挑战性；多种细胞死亡通路的上游调控机制及各通路的 functional 贡献仍需充分阐明；MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞之间gasdermin切割模式的差异可能涉及细胞特异性炎症小体相关组分的调控；caspase-8作为整合凋亡、焦亡和坏死性凋亡信号的关键调控节点，其在HYP-siHIF介导的细胞死亡中的具体贡献需进一步研究。此外，本研究仅限于体外TNBC细胞模型，未直接评估HYP-siHIF对正常乳腺上皮细胞的选择性毒性，未来的研究需要结合缺氧培养系统、TNBC动物模型、药代动力学、生物分布和毒性评估，以进一步验证HYP-siHIF的治疗可行性、安全性和转化潜力。
研究结论：本研究表明，HYP-PDT联合siHIF在MDA-MB-231和MDA-MB-468 TNBC细胞模型中表现出协同抗肿瘤效应，并提供了支持PANoptosis相关细胞死亡通路激活的证据。研究结果提示，HYP-siHIF增强细胞内ROS蓄积，促进凋亡、焦亡和坏死性凋亡相关信号事件。综上，HYP-PDT与siHIF的联合代表了一种潜在的TNBC治疗方法，值得在缺氧模型和体内系统中进行进一步研究。
